异亮氨酸生产菌的全局代谢网络改造策略

【摘要】L-异亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，可作为食品营养补充剂、药物和饲料添加剂。本文主要综述了谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌合成L-异亮氨酸的调控机制和全局代谢网络改造策略现状，重点阐述基因工程技术在 L-异亮氨酸产生菌改造中的应用。

【关键词】L-异亮氨酸 基因工程 改造策略

【中图分类号】R459.7     【文献标识码】A       【文章编号】1004-7484（2019）10-0035-02

【Abstract】 L-isoleucine is a branched-chain amino acid and an essential amino acid for humans. It can be used as a food nutrition supplement， medicine and feed additive. This article mainly reviews the control mechanism of L-isoleucine synthesis by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli and the status of global metabolic network transformation strategies， and focuses on the application of genetic engineering technology in the transformation of L-isoleucine producing bacteria.

【Keywords】 L-isoleucine  genetic engineering  modification strategy

异亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，在食品领域主要用于食品添加剂，在医药领域主要用于氨基酸输液成分之一，而且它的需求量在逐年增加[1]。传统意义上的L-异亮氨酸生产菌株大多数是由野生菌株经过物理或化学的方法经过多轮诱变筛选获得。研究发现，基因突变往往充满着很多不确定性，而且在高通量筛选菌种时工作量较大，此外反复使用同一种诱变因子可能会出现钝化现象并且引起微生物的回复突变，使诱变育种变得不易控制[2]。基因工程技术的发展为L-异亮氨酸高产菌株的筛选提供了全新选择，该技术主要基于目前研究人员对L-异亮氨酸合成途径和调控机制的深入了解，定向改造有利于L-异亮氨酸合成的某些基因或其代谢途径，使碳源最大化流向L-异亮氨酸同时解除L-异亮氨酸的自身反馈抑制，因此利用这种方法获得的L-异亮氨酸高产菌株产量高且遗传性状稳定。

1L-异亮氨酸的合成途径与调控机制

谷氨酸棒杆菌是L-异亮氨酸生产菌的常用菌株，其产L-异亮氨酸的生物合成途径、调控机制及其运输系统如图1所示。L-天冬氨酸首先经过L-天冬氨酸激酶（AK）、天冬氨酸半醛脱氢酶（ASD）、高丝氨酸脱氢酶（HDH）、高丝氨酸激酶（HSK）和苏氨酸合酶（TS）催化的五步酶学反应转化生成L-苏氨酸[3]。AK 由lysC基因编码合成，其活性受到 L-苏氨酸和L-赖氨酸协同反馈抑制，是L-异亮氨酸合成途径上的第一个关键酶;HDH由hom基因编码，是L-异亮氨酸合成途径上的第二个关键酶，调控HDH催化的酶反应是控制碳流流向支路的关键之处，其表达受到L-甲硫氨酸的轻微反馈阻遏;HSK是由thrB基因编码，可将高丝氨酸磷酸化形成磷酸高丝氨酸，可控制流向苏氨酸合成的碳流，其酶活性受到L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制，是L-异亮氨酸合成途径上的第三个关键酶;苏氨酸脱水酶（TD）对苏氨酸的脱氨基，可控制L-苏氨酸到L-异亮氨酸的碳流，是L-异亮氨酸合成途径上的第四个关键酶;乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）催化丙酮酸和2-酮基丁酸生成乙酰羟丁酸，由于该酶还可以催化合成L-缬氨酸和L-亮氨酸，所以其决定了不同产物的碳流，是L-异亮氨酸合成途径的第五个关键酶[4-5]。

大肠杆菌是另一个常用的L-异亮氨酸生产菌株，它的L-异亮氨酸生物合成途径及调控机制如图2所示，与谷氨酸棒杆菌略有区别[6]。L-天冬氨酸先经五步反应合成L-苏氨酸，L-苏氨酸再经五步反应后生成L-异亮氨酸，与谷氨酸棒杆菌不同的是AK有三个同工酶为AKⅠ、Ⅱ和Ⅲ，分别由thrA、metL和tysc编码。AKⅠ、Ⅱ和Ⅲ具有不同的调控机制，在基因水平上，thrA和tysc的表达分别由L-苏氨酸和 L-赖氨酸诱发的转录衰减调控，而metL 的表达则由 L-甲硫氨酸诱导的阻遏蛋白MetJ调控在蛋白质水平上，AKI和AKⅡ是双功能蛋白，同时具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的活力，分别受 L-苏氨酸和L-赖氨酸的反馈抑制调控。大肠杆菌中有三个乙酰羟基酸合成酶（AHAS）的同工酶，分别为AHASⅠ、Ⅱ和Ⅲ并分别由由ilvBN、ilvGM和ilvlH编码与AK类似，这三种同工酶具有不同的调控机制。ilvGM的表达由L-异亮氨酸诱发的转录衰减调控。这三种AHAS同工酶竞争同一个底物丙酮酸，丙酮酸是支链氨基酸合成的重要前体，相比之下ilvBN编码的AHASI对丙酮酸的亲和力远高于对2-酮基丁酸的亲和力。因此，AHASI主要参与 L-亮氨酸和L-缬氨酸的生物合成，而AHASⅡ和Ⅲ主要参与L-异亮氨酸的合成[7]。

2 L-异亮氨酸的代谢工程改造

2.1运输载体改造对L-异亮氨酸产量的影响研究发现，L-异亮氨酸的产率与跨膜转运机制有密切的关系。Morbach S等对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的研究发现胞内L-异亮氨酸浓度始终大于胞外L-异亮氨酸浓度[8]，Kelle R等人发现高浓度的L-异亮氨酸对细胞有毒害作用[9]。BrnFE是谷氨酸棒桿菌中负责支链氨基酸L-异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸转运运输的双组份转运载体，由brnFE 基因编码，当谷氨酸棒杆菌胞内的支链氨基酸量积累到一定程度时，便会激活 brnFE 操纵子表达使得L-异亮氨酸等氨基酸外排到胞外。通过过表达 brnFE 基因，可以减少 L-异亮氨酸在谷氨酸棒杆菌胞内的积累，削弱L-异亮氨酸在胞内对合成途径中关键酶的反馈抑制作用，从而增加其产量。李忠财等人在谷氨酸棒杆菌LD320 中分别过表达突变型和野生型的双组份转运系统BrnFE操纵子，构建了重组菌LD320pXMJ19-brnFE1通过添加适量的表面活性剂，通过7L发酵罐放大实验，发现该菌株L-异亮氨酸的产量由18.53 g/L提高到25.45 g/L[10]。大肠杆菌中，支链氨基酸（BCAAs）的输出蛋白brnFE高效表达也可提高L-异亮氨酸产量。

2.2 辅酶改造对L-异亮氨酸产量的影响L-异亮氨酸所需的关键辅酶是NADPH，它也是ASD、HD、乙酰羟酸合酶（AHAIR）的辅酶，此外NADPH还是细胞内最重要的还原力在还原性生物合成中起到氢供体的作用。细胞内NADPH的主要供应渠道是HMP途径和NAD激酶，其中HMP途径利用氧化态辅酶Ⅱ（NADP+）作为电子受体生成还原态辅酶Ⅱ（NADPH），NAD激酶则催化辅酶Ⅰ发生磷酸化生成辅酶Ⅱ。研究表明，高效供应NADPH有利于发挥菌株的合成潜力，可促进L-异亮氨酸的进一步积累。还晓静等人通过在谷氨酸棒杆菌中过表达NAD激酶（ppnk编码）成功构建由ppnK组成表达菌JHI3-156/pDXW-9-ppnK，L-异亮氨酸的产量提高了41.7%[11];Shifeng等人利用辅酶工程在谷氨酸棒杆菌中增加NADPH的供应，敲除内源性NAD+激酶基因ppnK同时将葡萄糖-6磷酸脱氢酶基因zwf与L-异亮氨酸双加氧酶（ido）共表达提高L-异亮氨酸的前体物质4-羟基异亮氨酸（4-HIL）的产量，L-异亮氨酸产量达到84.14±6.38mM[12]。

2.3 代谢通路改造对L-异亮氨酸产量的影响

2.3.1增强主合成途径

2.3.1.1通过表达关键酶以解除自身反馈根据L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制，使菌体最大化生成L-异亮氨酸的方法主要是增加其前体物质的合成、解除自身反馈抑制以及切断代谢支路。通过基因工程手段能很好地改造L-异亮氨酸产生菌的代谢通路，例如过表达某些关键酶基因可以有效解除自身反馈抑制、敲除支链代谢的相关基因可以使碳流最大化流向目标产物。基因工程手段精准且有效地改变L-异亮氨酸产生菌的代谢通路，已成为很多研究者青睐的方法。尹良鸿等人在谷氨酸棒杆菌JHI3-156中共表达反馈抗性苏氨酸脱水酶和乙酰羟基酸合酶，经72小时分批补料发酵可生产L-异亮氨酸30.7 g/L[13];徐庆阳等人通过在谷氨酸棒杆菌中过表达hom基因成功构建谷氨酸棒杆菌 YILW（pXMJ19-hom），由于解除了高丝氨酸脱水酶的反馈抑制，使得L-异亮氨酸的产量增加了10.3%，达到32g/L[14];此外他通过异源表达钝化发现谷氨酸棒杆菌JHI3-156的苏氨酸脱水酶（TD1）和乙酰羟基胺酸合酶（AHAS1）均具有抗反馈抑制能力，在谷氨酸棒杆菌JHI3-156中过量表达TD1或AHAS1均能提高L-异亮氨酸的产量，组合表达时摇瓶发酵提高131.7%的L-异亮氨酸，发酵罐发酵提高26.3%的L-异亮氨酸;李燕军等人以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株，利用基因重组技术替换 ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH，获得了L-异亮氨酸高产菌株ILE04，该菌株在5L发酵罐中L-异亮氨酸的产量为5.23g/L[15];温冰、徐国栋等人采用基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株谷氨酸把那个杆菌YILW的 ilvBNC操纵子中的启动子替换为强启动子Ptac获得谷氨酸棒杆菌YILWPtacpXMJ19cimA，其L-异亮氨酸酸产量和核糖转化率分别较出发菌株提高14.8%和18.6%，在此基础上过表达cimA基因，L-异亮氨酸產量和糖酸转化率较出发菌株提高了14.5%和42.4%[16]。

2.3.1.2增加前体物质的合成异亮氨酸的前体物质主要有天冬氨酸，苏氨酸等，增加相关的前体物质能积累大量的目标产物。Feng Shi等人在重组谷氨酸棒杆菌中过表达基因ppc（编码PEPC-磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）和lysC（编码AK）再将ppc和lysC与ido共表达以增加4-HIL的直接前体L-异亮氨酸的供应[17];乙酰羟基酸合成酶（acetohydroxyacid synthase， AHAS）是L-异亮氨酸合成途径的关键酶（L-由 ilvBN 编码），α-酮基丁酸是 L-异亮氨酸合成的重要前体，因此强化 ilvBN 的表达以及增加α-酮基丁酸的供应理论上可提高L-异亮氨酸的合成。赵建勋在谷氨酸棒杆菌IWJ001中表达RRF和EF-G，后续共表达合成途径关键酶基因ilvBNA和辅酶基因ppnk，L-异亮氨酸产量提高了76.5%[18]。

2.3.1.3增强回补途径以增加L-异亮氨酸的产量增强回补途径是增加L-异亮氨酸产量的重要方法，研究表明回补途径的增强确实可以提高L-异亮氨酸的产量。ZHU Fuzhou等人以谷氨酸棒杆菌Y1为出发菌株，采用基因组整合和质粒过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc及丙酮酸羧化酶编码基因pyc，获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01，摇瓶条件下L-异亮氨酸产量提高了17.3%，发酵罐条件下提高11.7%;获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03，摇瓶条件下L-异亮氨酸产量提高了30.8%，发酵罐条件下提高15.8%[19]。

2.3.2减少副产品的积累在L-异亮氨酸的合成途径上，其他氨基酸等竞争代谢产物的存在极大减少了L-异亮氨酸的合成，支链代谢产物会分走很大部分碳流，理论上减弱这些旁路氨基酸的合成，可以大大加强L-异亮氨酸合成途径的碳流从而积累更多的L-异亮氨酸。Yuanxiao DONG等人通过敲除ddh和lysE基因，从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中构建不产生赖氨酸的基础菌株，通过过表达相关基因L-异亮氨酸的产量有明显提高[20]。

3 总结及展望

传统上主要结合随机突变、定向筛选高产L-异亮氨酸高产菌，但是由于突变的不确定性且筛选工作量大等原因，目前菌种改造多采用基因工程手段。基因工程手段以菌株代谢背景清楚为前提，对一个点或多个点进行基因水平上的改造，对代谢途径中多个关键酶高效表达以解除一些反馈抑制，此外构建新的代谢途径逐渐走入人们视野。本文主要概述了L-异亮氨酸生产菌的全局代谢网络改造策略以及基因工程在L-异亮氨酸生产菌全局代谢网络改造中的应用现状，旨在为相关研究者提供一些参考。当前，我国的相关研究也处在刚刚起步的阶段，随着系统生物学等相关学科的不断发展，将相关学科的新技术相互结合用于选育更高产L-异亮氨酸的菌株成为新的挑战和发展方向，并且提出更精准、更全面、更合理的改造策略，使得L-异亮氨酸成本降低且产量有明显的提升以满足日益增长的生产生活需要。

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作者简介：李晓芳（1994.9-）女，内蒙古自治区兴安盟突泉县，汉，研究生，宁夏大学食品与葡萄酒学院，研究方向：微生物育种。