生鲜猪肉中吡哌酸残留的共振光散射检测研究

刘 艳， 李莉娟， 肖双宏， 陈明媛， 江 虹

(长江师范学院化学化工学院，长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100)

吡哌酸(Pipemidic Acid，PPA)是一种喹诺酮类广谱抗菌药，是人、畜共用药物。该药在临床上主要用于治疗由敏感革兰阴性杆菌和葡萄球菌所致的尿道炎、膀胱炎、菌痢、肠炎、中耳炎等，在畜禽动物上已广泛作为预防和治疗用药，由此可能造成该药在动物源性食品中的残留，当人食用时，可通过食物链在人体内不断畜积，一旦畜积到一定程度，就会对人体产生毒性，从而影响人体健康。因此，对动物源性食品中吡哌酸残留进行研究有一定意义。

目前，国内外检测吡哌酸含量的方法主要有紫外分光光度法[1]、高效液相色谱法[2 - 6]、液-质联用法[7 - 11]和电化学法[12 - 13]等方法。但这些方法中，要么仪器较贵不易普及，要么前处理复杂，或条件要求苛刻或选择性欠佳等，故研究简便、易行的高灵敏分析方法很有必要。本工作以三苯甲烷类碱性染料亮绿(Brilliant Green,BLG)作探针，用普通荧光光谱仪及具有高灵敏的瑞利光散射技术研究生鲜猪肉中吡哌酸残留。本工作尚未见文献报道。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光分光光度计(日本，日立公司)；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

吡哌酸(PPA)(中国食品药品检定研究院，对照品批号：100151-201103)标准溶液：准确称取吡哌酸对照品适量，用0.010 mol/L HCl溶解后用水定容，配成303.3 mg/L标准贮备液，冰箱4 ℃保存，操作液浓度为3.033 mg/L。亮绿(BLG)(天津市光复精细化工研究所)溶液：1.0×10-4mol/L。Tris溶液：0.20 mol/L。HCl：0.10 mol/L。Tris-HCl缓冲溶液：用适量HCl和适量Tris溶液混合，用pH计测定，配成pH=3.0～9.6的溶液。水为二次蒸馏水。

市售生鲜猪肉(1#和2#)。

1.2 样品处理

取适量1#和2#猪肉样品，洗净后切块并搅成肉末。分别称取肉末15 g左右(称准至0.000 1 g)，加10 mL 0.010 mol/L HCl，使吡哌酸充分溶出，搅匀后超声提取约40 min，再以4 000 r/min离心20 min，上清液转入烧杯中。按上述方法重复提取一次，合并两次上清液，加1∶1甲醇溶液40 mL，超声提取30 min，再以4 000 r/min离心20 min，上清液置于小烧杯中，在100 ℃水浴中浓缩至约2 mL。各样品平行处理5份。

1.3 实验方法

精密移取2.50 mL pH=9.56的Tris-HCl缓冲溶液于10 mL 具塞比色管中，再依次加入2.50 mL 1.00×10-4mol/L亮绿溶液和适量3.033 mg/L吡哌酸标准溶液，摇匀后用水稀至刻度，再摇匀，15 min后，在荧光分光光度计上，以测定狭缝5.0 nm，λex=λem=220 nm，扫描共振光散射(RLS)光谱，记录波长370 nm处该体系及试剂空白的RLS强度IRLS及I0，计算ΔIRLS=IRLS-I0。

2 结果与讨论

2.1 共振光散射光谱

图1 亮绿-吡哌酸的共振光散射光谱Fig.1 RLS spectra of brilliant green and pipemidic acid1.0.303 mg/L PPA;2.2.50×10-5 mol/L BLG;3-8.0.0,0.0607,0.121,0.182,0.243,0.303 mg/L PPA-2.50×10-5 mol/L BLG,pH=9.56.

从图1可见，单独的吡哌酸溶液的RLS十分微弱，亮绿溶液的RLS也较微弱，而亮绿在碱性环境(pH=9.56)中，其RLS强度显著增强，最大RLS峰位于370 nm。当在亮绿的碱性溶液中加入吡哌酸标准溶液后，由于亮绿是一种碱性阳离子染料，在溶液中以阳离子形式存在，吡哌酸结构上含有羧酸根离子，在溶液中以阴离子形式存在，于是二者以静电引力结合生成二元离子缔合物，其摩尔质量增大，导致RLS明显增强。从曲线3～8可知，随着吡哌酸浓度的逐渐增大，体系的RLS强度随之增强。当吡哌酸浓度在0.303 mg/L以内时，其质量浓度与体系的RLS增强强度(ΔIRLS)呈线性关系，故该方法可用于吡哌酸的定量分析。

2.2 适宜反应条件

2.2.1 介质、酸度及用量的影响考察了HAc-NaAc、B-R、Tris-HCl、NaOH溶液对体系IRLS的影响。结果表明，使用Tris-HCl溶液作反应介质时，RLS相对较强，ΔIRLS较大(ΔIRLS=412)，故选择用Tris-HCl作反应介质。继而考察了酸度对体系IRLS的影响，结果见图2。实验表明，体系在酸性范围内受酸度影响较小，在碱性范围内受酸度影响很大，可见最适酸度为pH=9.56，体系的ΔIRLS最大(ΔIRLS=425))，灵敏度最高。随即考察了其用量对体系IRLS的影响，结果表明当pH=9.56 Tris-HCl溶液用量为2.50 mL时，RLS相对最强，ΔIRLS最大(ΔIRLS=446)，灵敏度最高。实验选择用2.50 mL pH=9.56 Tris-HCl溶液来控制体系的酸度。

2.2.2 亮绿溶液浓度的影响考察了5.00×10-6～4.00×10-5mol/L范围内亮绿浓度对体系IRLS影响，结果见图3。结果表明，亮绿在2.20×10-5～2.80×10-5mol/L范围内，最佳浓度为2.50×10-5mol/L。当亮绿浓度大于或小于最佳值时，体系的ΔIRLS均有不同程度降低，降低原因要么是亮绿用量不足，使缔合反应不完全，要么是亮绿过量太多，自身聚集作用增强，均导致体系ΔIRLS降低，灵敏度降低。实验选择用2.50 mL 1.00×10-4mol/L亮绿溶液。

图2 pH值对ΔIRLS的影响Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLSPPA:0.303 mg/L;BLG:2.00×10-5 mol/L.

图3 亮绿浓度对ΔIRLS的影响Fig.3 Effect of BLG concentration on ΔIRLSPPA:0.303 mg/L;pH=9.56.

2.2.3 试剂加入顺序的影响考察了吡哌酸、亮绿及Tris-HCl不同加入顺序对体系IRLS强度的影响。结果表明，加入顺序为吡哌酸、亮绿、Tris-HCl时，ΔIRLS=480；加入顺序为Tris-HCl、亮绿、吡哌酸时，ΔIRLS=495；加入顺序为吡哌酸、Tris-HCl、亮绿时，ΔIRLS=483。可见，最佳加入顺序为Tris-HCl、亮绿、吡哌酸。实验按最佳加入顺序进行。

2.2.4 反应时间的影响考察了缔合反应时间对体系IRLS强度的影响。结果表明，开始时随着缔合反应的进行，体系ΔIRLS逐渐增大，当达15 min时，ΔIRLS最大(ΔIRLS=506)，15 min后至120 min内，ΔIRLS不再增大，基本处于稳定状态。实验选在15 min后测定。

2.3 吡哌酸浓度与ΔIRLS的关系

分别取3.033 mg/L吡哌酸标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于10 mL比色管中，按实验方法加入其它试剂溶液，扫描RLS光谱。以吡哌酸质量浓度为横坐标，ΔIRLS为纵坐标作标准曲线。线性回归方程为：ΔIRLS=2.191+1646c，相关系数r=0.9997。该体系的线性范围为0.007～0.30 mg/L，检出限为0.0063 mg/L，定量限为0.014 mg/kg。

2.4 共存物质的影响

2.5 样品分析

取已处理的猪肉样品1#和2#浓缩液，按实验方法，用共振光散射技术于370 nm处检测样品溶液中吡哌酸的含量。同时，以空白猪肉样为样品，进行3个不同加标浓度的回收试验(n=5)。结果见表1。最后将测定结果与国家标准方法(UV法)对照，再判断方法的准确度和精密度(RSD)。

表1 样品分析结果及回收试验(n=5)

ND:notdetected.

3 结论

依据亮绿与吡哌酸的缔合反应，用RLS技术检测生鲜猪肉中的吡哌酸药物残留，方法具有高的灵敏度和选择性，较高的准确度和精密度。测定结果与国家标准方法一致，但灵敏度高于国家标准方法(RLS法比UV法高4个数量级)。该方法简便、快速，样品处理安全、所用仪器易于普及。该法适于生鲜猪肉中吡哌酸的残留分析。