反相离子对色谱法测定格列吡嗪片中5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量

崔 静，于小童

（淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

格列吡嗪的化学名为1-环己基-3-{4-[2-(5-甲基吡嗪-2-酰胺)-乙基]苯磺酰}脲，是美国辉瑞公司开发的第二代磺酰脲类口服降糖药，1984年在美国上市[1]。格列吡嗪主要应用于2型糖尿病患者的治疗，其作用机制为促胰岛β细胞分泌胰岛素[2]。

《中国药典》2015年版二部收载了格列吡嗪及其片剂，其有关物质项均只检查4-[2-（5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基）乙基]苯磺酰胺（杂质Ⅰ）的含量[3]，而可能存在的5-甲基吡嗪-2-羧酸既是格列吡嗪合成时使用的起始物料[1]，又是格列吡嗪酰胺键断裂时产生的杂质[4]，因此，监控5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量对于格列吡嗪片的质量控制非常有必要。由于5-甲基吡嗪-2-羧酸的酸性强，中国药典、美国药典、欧洲药典等收载的有关物质检查方法中的色谱系统中均不适于该杂质的含量测定，因此，本文建立了反相离子对高效液相色谱法测定5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量[5-8]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 高效液相色谱仪，包含四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（美国安捷伦）；CP225D电子天平（德国赛多利斯）；ML204电子天平（瑞士梅特勒）。

1.2 试药

5-甲基吡嗪-2-羧酸（Sigma-Aldrich公司）；格列吡嗪片（仁和堂药业，批号：170901，171101，180504，规格：5 mg）；甲醇（色谱纯，默克股份两合公司）；10 %四丁基氢氧化铵溶液（分析纯，上海麦克林）；磷酸二氢钠（分析纯，国药集团）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；检测波长：276 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl；流动相A：50 mmol/LNaH2PO4溶液（含0.05 %四丁基氢氧化铵），流动相B：甲醇，按表1梯度洗脱。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 取5-甲基吡嗪-2-羧酸对照品约25 mg，精密称定，用5 %甲醇溶液溶解并稀释制成每1 ml含12.5 μg的溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 取对照品贮备液，用5 %甲醇溶液溶解并稀释制成每1 ml含0.5 μg的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取格列吡嗪片10片，研细，精密称取适量（约相当于格列吡嗪25 mg），置入50 ml量瓶，加5 %甲醇溶液适量，强力振摇并超声15 min使5-甲基吡嗪-2-羧酸充分溶解，再加5 %甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.4 系统适用性溶液的制备 取格列吡嗪片10片，研细，精密称取适量（约相当于格列吡嗪25 mg），置入50 ml量瓶，用对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密量取空白溶剂（5 %甲醇溶液）、系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（见图1）。结果：系统适用性溶液中主峰无相邻杂质峰，空白溶剂对5-甲基吡嗪-2-羧酸测定无干扰，该色谱条件适用于5-甲基吡嗪-2-羧酸含量的测定。

图1 HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察 精密称取对照品25.13 mg，用5 %甲醇溶液溶解并稀释制成0.05026，0.1005，0.2513，0.5026，1.0052，1.5078，2.0104 μg/ml的溶液，分别精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，以浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=79 027.3X+6355.88（r=0.9999），表明在0.05026～2.0104 μg/ml范围内，5-甲基吡嗪-2-羧酸浓度与峰面积线性关系良好。

2.3.3 定量限和检测限 用5 %甲醇溶液将对照品溶液逐级稀释制成一系列不同浓度，分别精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。当信噪比约为10时，作为定量限浓度。当信噪比约为3时，作为检出限浓度。定量限为0.05026 μg/ml，检测限为0.01508 μg/ml。

2.3.4 系统精密度试验 取定量限溶液连续进样6次，5-甲基吡嗪-2-羧酸峰面积RSD为0.5 %（n=6），表明精密度良好。

2.3.5 溶液稳定性试验 对照品溶液和系统适用性溶液于室温下放置，分别在0，2，4，6，8 h时精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液主成分峰面积的RSD为0.8 %，系统适用性溶液主成分峰面积的RSD为0.3 %，溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.6 准确度 取格列吡嗪片（批号：170901）适量，研细，精密称取适量（约相当于格列吡嗪25 mg，5-甲基吡嗪-2-羧酸含量为0.0080 %），置入50 ml量瓶，平行称取9份，每3份为一组，分别精密加对照品贮备液1，2，3 ml，加5 %甲醇溶液适量，强力振摇并超声15 min，使5-甲基吡嗪-2-羧酸充分溶解，再用5 %甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。按2.1项色谱条件进样测定，平均回收率为99.20 %，RSD为0.9 %，表明准确度良好，结果见表2。

2.3.7 重复性 照2.2.3项方法，平行制备6份供试品溶液。精密量取对照品溶液、供试品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。5-甲基吡嗪-2-羧酸平均含量为0.041 %，RSD为0.6 %，重复性良好。

表2 回收率试验结果

2.4 样品测定

取3批格列吡嗪片，批号分别为170901、171101、180504，照2.2.3项方法，配制供试品溶液，测得结果分别为0.0080 %，0.0084 %，0.0079 %。

3 讨论

3.1 用二极管阵列检测器提取5-甲基吡嗪-2-羧酸峰的紫外光谱，发现该物质的最大吸收波长为214 nm和276 nm。与214 nm相比276 nm波长处特征峰明显，故选择276 nm作为测定波长。

3.2 本文建立的反相离子对高效液相色谱法，在0.05026～2.0104 μg/ml浓度范围内线性关系良好，检出限为0.01508 μg/ml，本方法操作简单、灵敏度好、结果可靠。较使用色谱用水（用醋酸调pH 3.5）为流动相A、乙腈为流动相B[8]，本文的色谱条件分离效果更好。国内无关于格列吡嗪片中5-甲基吡嗪-2-羧酸杂质的检测方法的参考文献。经验证，本文所建立的方法操作简单、灵敏度好、结果可靠，适合用于格列吡嗪片中微量杂质5-甲基吡嗪-2-羧酸的测定。