TSK凝胶色谱系统测定多尼培南原料药中高分子聚合物

李用珍，刘兆讯，王军军，张 英，王龙江*

（1.山东达因海洋生物制药股份有限公司，山东 荣成 264300；2.威海海洋职业学院 食品工程系，山东 荣成264300）

多尼培南（doripenem，S-4661）为新型β-内酰胺碳青霉烯类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强、对多种G+菌和G-菌均有很强的抗菌活性[1-2]。该品种由日本盐野义制药株式会社开发，于2005年在日本上市，2007年10月美国FDA批准该药注射剂用于临床治疗多种细菌引起的复杂性腹腔内感染及多种细菌引起的复杂性泌尿道感染。在β-内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应中，药物分子本身只是半抗原，药物中存在的高分子聚合物才是引发速发型过敏反应的真正过敏原[3]，控制β-内酰胺抗生素中聚合物的含量是减少临床中过敏反应的有效措施[4]。彭洁等[5]采用高效液相色谱法（HPLC）发现注射用多利培南中的杂质，并使用液相色谱-质谱法（LC-MS）推测杂质可能为多利培南的二聚物，但未对其他可能存在的高分子聚合物进行控制。本文采用凝胶色谱法对多尼培南原料药中的聚合物加以控制，对凝胶色谱柱、检测波长、流动相等加以优化，并在此基础上进行了相应的方法学验证，为确保多尼培南原料药的质量提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695-2489，e2695-2998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AB204-S，AB265-S电子天平（梅特勒-托利多）；TSK-GEL G2000SW色谱柱（7.5 mm×600 mm，10 μm，Tosoh Corporation）；Sephadex G-10葡聚糖凝胶柱（10 mm×300 mm，40～120 μm，大连依利特）；pHS-3F型pH计（雷磁-上海仪电）。

1.2 试药

无水磷酸二氢钠，无水磷酸氢二钠（分析纯，国药集团）；乙腈（色谱纯，Fisher）；多尼培南原料药（自制，批号：160801，160802，160803）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：TSK-GEL G2000SW（7.5 mm×600 mm，10 µm）葡聚糖凝胶柱；流动相：pH 7.0磷酸盐缓冲液[5 mmol/L磷酸氢二钠溶液-5 mmol/L磷酸二氢钠溶液（61:39）]:乙腈=90:10，流速：0.7 ml/min，检测波长：298 nm，柱温：30 ℃。

取多尼培南供试品（批号：160801）约20 mg，精密称定，置入10 ml量瓶，加0.01 mol/L NaOH溶液1 ml，室温下放置5 min，加0.01 mol/L HCl中和后，加纯化水溶解并定容至刻度。取上述碱破坏溶液20 μl注入液相色谱仪，理论塔板数按多尼培南峰计不低于3000，主峰与高分子聚合物峰的分离度≥1.5。

图1 系统适用性试验HPLC图谱

2.2 供试品溶液制备

取供试品（批号：160801）约20 mg，精密称定，置入10 ml量瓶，加纯化水溶解并定容至刻度，摇匀制备成每1 ml约含2 mg的溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 强制破坏实验 取多尼培南供试品（批号：160801）适量，精密称定，制成每1 ml约含2 mg的溶液 ，精密量取10 ml，按表2条件进行强制破坏，以考察在各种降解条件下高分子聚合物对主成分的影响，结果见表1，图2～5。

表1 多尼培南高分子聚合物强制降解试验结果

图2 碱破坏样品与供试品HPLC图谱对比

图3 酸破坏样品与供试品HPLC图谱对比

图4 氧化破坏样品与供试品HPLC图谱对比

图5 高温、高湿、光照破坏样品与供试品HPLC图谱对比

2.3.2 溶液稳定性试验 取供试品约20 mg，置入10 ml量瓶，精密称定，加纯化水溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 ml约含2 mg的溶液，作为供试品溶液。室温下，分别于0，1，2，3，4，5 h精密量取供试品溶液20 μl，注入色谱仪，考察供试品溶液的稳定性，结果表明室温下5 h内，不同时间点供试品主峰峰面积的相对偏差（RD）分别为-0.10 %，-0.36 %，-0.15 %，-0.19 %，-0.46 %，均小于0.5 %；高分子聚合物峰面积的RD分别为1.85 %，1.31 %，1.20 %，1.53 %，2.53 %，均小于5.0 %，符合要求。

2.3.3 检测限和定量限 逐步稀释供试品溶液，自动进样，记录色谱图，计算信噪比。多尼培南溶液浓度约为0.04 µg/ml时，主峰的S/N为3～4，所测3份检测限溶液峰面积的RSD≤10.0 %（0.72 %）；溶液浓度约为0.1 µg/ml时，主峰的S/N为9～10，所测6份定量限溶液的峰面积的RSD≤10.0 %（0.71 %）。

2.3.4 线性关系试验 在0.1～8 µg/ml 浓度范围内选取1.007，2.014，4.028，6.042 ，8.056 µg/ml 5个浓度，以浓度（C，µg/ml）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程：A=29 789C-1381.7，相关系数r=0.9999。结果表明：多尼培南在0.1～8 µg/ml范围内峰面积与浓度的线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

2.3.5.1 重复性试验 取同一批多尼培南（批号：160801），精密称定6份，按2.1项色谱条件测定，主峰前杂质峰面积之和与样品质量的比值（A/M）的RSD为1.14（n=6），小于2.0 %，重复性满足要求。

2.3.5.2 中间精密度试验 取同一批多尼培南，精密称定12份，由两位分析员分别在两天、两台不同仪器上按2.1项色谱条件测定，A/M的RSD为1.59 %（n=12），小于2.0 %，中间精密度满足要求。

2.3.6 耐用性试验 分别改变流速、流动相pH、乙腈比例及更换色谱柱，其余条件不变，分别制备系统适用性试液和供试品溶液，以系统适用性试验和供试品的检测结果评价方法的耐用性，结果见表2。由表2可见，原色谱条件供试品检测结果与改变色谱条件后检测结果RD在±2 %以内，说明此方法具有良好的耐用性。

表2 耐用性试验结果

2.4 样品测定

取本品（批号：160801，160802，160803）适量，按2.1项色谱条件测定样品中的聚合物的含量，3批样品中聚合物的含量分别为0.11 %，0.11 %，0.11 %。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

配制2 mg/ml多尼培南溶液，采用TSK-GEL G2000SW色谱柱，在液相色谱仪（PDA检测器）上扫描200～400 nm区间的光谱图。由图谱可见，多尼培南主成分和主峰前的高聚物峰均在298 nm附近有最大吸收，故检测波长选择298 nm。

3.2 色谱柱的选择

Sephadex G-10交联葡聚糖凝胶柱在β-内酰胺抗生素高分子聚合物的检测中已得到广泛应用[6-13]。以2 mg/ml多尼培南溶液作为供试品溶液，分别采用Sephadex G-10（10 mm×300 mm，40～120 μm）及TSK-GEL G2000SW（7.5 mm×600 mm，10 μm）两种凝胶色谱柱对多尼培南中的高分子聚合物进行分析。结果显示，采用G-10凝胶柱时主峰峰展较宽，对于高分子杂质分离不利；而TSKGEL G2000SW主峰的峰形较好，因其粒径小导致其理论塔板数高，分离效率高，能有效分离高分子聚合物与主成分，故选择TSK-GEL G2000SW作为多尼培南原料药聚合物控制的色谱柱。

3.3 流动相pH的选择

鉴于多尼培南在酸性或碱性，尤其是碱性条件下易降解，进一步产生高分子聚合物杂质，结合TSK-GEL G2000SW色谱柱适用范围为2.5～7.5，分别选择pH 7.0，6.5，6.0，5.5的磷酸缓冲盐[5 mmol/L磷酸二氢钠-5 mmol/L磷酸氢二钠（61:39）]-乙腈=95:5）进一步研究。结果显示，随着pH值的降低，主峰及高聚物的保留延后，从分离度及主成分的理论塔板数来看，pH值对高聚物的检测无显著影响，鉴于多尼培南在酸、碱性条件下均不稳定，故选择流动相的pH为7.0。

3.4 流动相离子强度的选择

分别选择0.005，0.01，0.05 mol/L不同离子强度的流动相进行考察。随着离子强度的增加，多尼培南高聚物因其自身的氨基、羧基发生解离，高聚物峰面积逐渐减小，故选择检测的离子强度选择0.005 mol/L。

3.5 计算方法的选择

由于高聚物本身不稳定，对照品不易制备，以外标法定量有一定的难度。选择自身对照法（1 %自身对照溶液）和面积归一化法进行比较，结果见表3。

表3 不同计算方式结果比较

由表3可见，自身对照法和面积归一化法检测聚合物结果变化不明显，面积归一化法检测结果大于自身对照法检测结果，选择面积归一化法计算聚合物含量。

4 结论

相对于第一代碳青霉烯类药物在体内易被肾脱氢肽酶（DHP-1）水解，多尼培南具有与细菌青霉素结合蛋白（PBPS）亲和力强、抗菌活性高、对DHP-1稳定的特点，具有更好的临床应用价值和市场前景，对多尼培南原料药中的高分子聚合物进行控制，是减少临床致敏反应的有效措施。本文采用TSK凝胶色谱系统，通过对检测波长、色谱柱、流动相pH值及离子强度的筛选，初步建立了控制方法，并对其进行了全面的方法学验证，该方法简便、灵敏、准确、专属性强，可用于多尼培南高分子聚合物的检查。