洋甘菊多糖中单糖组分的高效液相色谱及高效毛细管电泳测定比较

陈 蕾，何新苗，孟 磊，马晓丽

（1.信阳市中心医院康复科，河南 信阳 464000；2.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

洋甘菊为菊科植物，母菊属，一年生草本植物，原产欧洲，学名为Matricaria chamomillaL.[1]，主要以干燥的花或全草入药，属于新疆特色地产药材[2-3]。洋甘菊具有消炎、镇定、舒缓的功效，是中成药祖卡木颗粒的主要成分之一。新疆特殊的生态环境使洋甘菊中含较丰富的黄酮、多糖、维生素和氨基酸等成分[4-6]。多糖类化合物具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、降血糖降血脂[9]、调剂免疫等生物活性。但有关药洋甘菊多糖中单糖组分的分析及活性研究未见报道。本研究采用超声水提、乙醇沉淀得到粗多糖，对高效液相色谱（HPLC）及高效毛细管电泳（HPCE）两种单糖组分测定方法进行比较，为洋甘菊多糖的功效研究测定奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司 ）；Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；P/ACE毛细管电泳仪（Benkman公司），配PDA检测器；未涂层毛细管柱（永年锐沣色谱器件公司，d=75 mm）；PHSJ-3F pH计（上海雷磁）；KQ-500PE型超声仪（昆山超声仪器公司）；DZKW-S-4水浴锅（北京永光明）。

1.2 材料

洋甘菊在成熟期采自新疆喀什市，由新疆医科大学徐海燕副教授鉴定为德国洋甘菊，粉碎过200目筛。葡萄糖对照品，甘露糖对照品，半乳糖对照品，鼠李糖对照品，半乳糖醛酸对照品，木糖对照品，阿拉伯糖对照品（纯度≥98 %，中国食品药品检定研究院）；乙腈（Fisher，色谱纯）；氯仿，甲醇，乙醇，三氟乙酸（分析纯，天津富宇）； HCl，NaOH（分析纯，洛阳市化学试剂厂）；乙酸铵（优级纯，天津光复）；冰乙酸（分析纯，西安化学试剂厂）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析纯，上海试剂二厂）。

2 方法与结果

2.1 粗多糖制备

取过200目筛的洋甘菊粉末约10 g，精密称定，置入锥形瓶，加100 ml超纯水，60 ℃超声30 min，过滤，滤渣在60 ℃下再次超声30 min，合并提取液，抽滤，将滤液转移至旋转蒸发仪，浓缩至10 ml，在其中加无水乙醇使含醇量达80 %，室温下静置24 h，得多糖沉淀，弃上清，沉淀物于60 ℃真空干燥12 h，即得干燥的洋甘菊多糖。

2.2 样品液的水解

精密称取洋甘菊多糖约0.01 g，共6份，分别置入安瓿瓶，分别加入2 mmol/L 三氟乙酸溶液2 ml，封口后于105 ℃放置4 h，减压回收三氟乙酸，超纯水溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，定容至5 ml，摇匀，即得供试液，4 ℃保存。

2.3 混合单糖对照品溶液配制

精密称取木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸7种单糖对照品适量，置入10 ml量瓶，制成浓度均为20 mmol/L的单糖对照品溶液，精密吸取7种单糖对照品溶液各1.0 ml，置入10 ml量瓶，定容，摇匀，即得。

2.4 衍生化处理

2.4.1 混合单糖对照品的衍生化 取混合单糖对照品溶液500 μl，加0.5 mmol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液500 μl，0.3 mmol/L NaoH溶液500 μl，涡旋30 s，置70 ℃水浴加热30 min，冷却至室温，加入0.3 mmol/L HCl溶液，涡旋30 s，加入2 ml氯仿，涡旋30 s，吸取下层液弃去，重复3次，吸取上层液体，过0.45 μm微孔滤膜，进样。

2.4.2 样品衍生化 精密吸取2.2项下洋甘菊多糖水解后供试液500 μl，按2.4.1项下方法进行衍生化。

2.5 色谱条件

2.5.1 HPCE色谱条件 熔融未涂层石英毛细管柱（d=75 mm）；缓冲液：180 mmol/L硼酸溶液，pH 10.05；柱温：25 ℃；电压：15 kV；气压进样：0.5 psi，进样时间：10 s；检测波长：245 nm。清洗程序：第1次进样前分别以甲醇、水、0.1 mol/L盐酸、水、0.1 mol/L NaOH、水、缓冲液，冲洗毛细管20 psi×5 min；每更换1次电泳缓冲液，均用缓冲液平衡至电流平稳（10 min）后才进样测定[6]。色谱图见图1。

2.5.2 HPLC色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙酸铵缓冲溶液（pH 5.5）-乙腈（22:78）；流速：1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量 ：10 μl；压力：0.4 Pa；检测波长：245 nm。色谱图见图2。

图1 HPCE色谱图（A：混合单糖对照品；B：洋甘菊多糖样品）

由图1、图2可见各单糖色谱峰与邻近峰均能达到基线分离，分离度＞1.5,理论塔板数＞3000，表明该方法具有良好的系统适应性，衍生化反应试剂不干扰各单糖的测定。

2.6 线性关系考察

分别按HPLC及HPCE检测方法配制系列浓度的混合对照品溶液，经衍生化后测定，HPLC以对照品浓度x（mmol/L）为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，相关系数R2＞0.99。HPCE以对照品浓度x（mmol/L）为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，相关系数R2＞0.99，结果见表1。结果表明两种方法的线性关系均良好。差别之处在于两种方法的线性范围不同，HPCE比HPLC的线性范围宽。

图2 HPLC色谱图（A：混合单糖对照品；B：洋甘菊多糖样品）

表1 7种单糖的标准曲线

2.7 精密度、重复性、稳定性

精密量取一定量的混合单糖对照品溶液，衍生化后，在上述色谱条件下，连续进样6次，进行日内精密度检查，测定峰面积，计算得HPCE测定各单糖峰面积的RSD值均在3 %以下，HPLC测定各单糖峰面积的RSD值均在1 %以下。二者精密度均符合测定要求，HPLC略优于HPCE。

精密称取一定量2.1项下洋甘菊多糖样品6份，水解、衍生化后，在上述色谱条件下进样，进行重复性检查，测定峰面积，HPCE与HPLC计算得各单糖峰面积的RSD值均在3 %以下。

精密量取一定量2.2项下供试品液，衍生化后，在上述色谱条件下，在0，2，4，6，8，12，24，48 h分别进样测定，进行稳定性检查，计算得HPCE测定各单糖峰面积的RSD值均在4 %以下，HPLC测定各单糖峰面积的RSD值均在3 %以下。结果表明48 h内各单糖色谱峰面积无明显变化，被测样品在48 h内稳定性良好。HPCE和HPLC的精密度、重复性、稳定性结果见表2。由表2可见，HPCE的精密度、重复性、稳定性均小于5 %，HPLC测定的精密度、重复性及稳定性均较好，小于2 %，优于HPCE。

表2 HPCE和HPLC的精密度、重复性、稳定性

2.8 加样回收率

精密称取已知含量的样品粉末约0.01 g，共9份，分为3组，按测定浓度的80 %，100 %，120 % 分别加入一定量混合单糖对照品溶液，按2.2项方法制备供试品溶液，衍生化处理后按2.5项色谱条件分别进行HPCE及HPLC分析，计算加样回收率。结果显示，HPCE和HPLC测定的平均回收率均在98.0 %～102.0 %之间，RSD值均在0.48 %～1.41 %之间，表明方法产生的误差小，实验操作规范。见表3、表4。

表3 HPCE加样回收率实验结果

表4 HPLC加样回收率实验结果

0.0 6 9 6 0.0 8 0.1 5 2 3 1 0 4.4 0 0.7 3 0.0 6 9 6 0.1 0 0.1 7 4 0 0.0 6 9 6 0.1 2 0.1 9 3 1葡萄糖0.0 9 3 2 0.0 8 0.1 6 2 1 8 5.2 0 0.6 4 0.0 9 3 2 0.1 0 0.1 7 8 4 0.0 9 3 2 0.1 2 0.1 9 5 4半乳糖0.1 6 6 3 0.0 8 0.2 4 7 3 9 9.4 0.9 6 0.1 6 6 3 0.1 0 0.2 6 5 7 0.1 6 6 3 0.1 2 0.2 8 7 2阿拉伯糖、木糖半乳糖醛酸0.0 8 9 4 0.0 8 0.1 7 1 4 1 0 3.4 0.4 8 0.0 8 9 4 0.1 0 0.1 9 2 8 0.0 8 9 4 0.1 2 0.2 1 2 5

2.9 样品中各单糖的含量

通过在多糖水解样品中加混合单糖对照品后峰增高法定性可知，HPCE测定出的洋甘菊多糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖7种单糖组成；由校正因子法计算得各单糖物质的量之比为1:1.53:3.10:4.12:7.28:2.27:0.90。HPLC测定洋甘菊多糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖与木糖7种单糖组成；其中阿拉伯糖与木糖在HPLC中未实现分离，出现叠峰，由于木糖含量较少，故本实验中HPLC测得的阿拉伯糖与木糖统称为阿拉伯糖。最终由校正因子法计算得甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖与木糖之和的物质的量之比为1:1.51:2.23:3.53:6.61:2.98。

3 讨论

本文采用 HPLC和HPCE两种方法分别对洋甘菊多糖中单糖组成进行了分析。本实验以超声提取为主要手段，采用传统的热水浸提、乙醇沉淀法得到洋甘菊粗多糖，实验中HPLC和HPCE条件均在文献基础上进行了优化[8-9]。线性实验结果显示，HPCE灵敏度较高；精密度方面HPLC优于HPCE。加样回收实验结果表明，二者加样回收率均能满足测定要求，且结果相近。

本研究发现，HPLC测定多糖时，阿拉伯糖与木糖出现叠峰，无法完全分离，其原因可能是二者在结构上属同分异构体，因此在普通液相色谱系统下难以分开，而HPCE可有效分离两种单糖，虽然文献报道HPCE重现性差，但在单糖分析中可作为HPLC的补充方法辅助区分阿拉伯糖与木糖。且本研究采取了以下措施：毛细管电泳仪每次进样前，分别以甲醇、水、0.1 mol/L盐酸、水、0.1 mol/L NaOH、水、缓冲溶液冲洗毛细管5 min；每更换1次电泳缓冲液，均用缓冲液平衡至电流平稳（10 min）；减小操作电压（15 kV）；利用冷却液尽快除去热量，使系统尽可能保持恒温。结果证实这些办法可有效改善HPCE在精密度、稳定性方面的不足，使测定结果满足需要。