术中冰冻优化弹力纤维染色在肺癌浸润程度诊断中的成效分析

陈惠玉 林洁 陈小岩

作者单位：福建省立医院病理科，福建 福州 350001

肺癌是常见的胸部恶性肿瘤，近年来其发病率逐年上升[1-2]。2009年，国际抗癌联盟发布第7版肿瘤TNM分期标准（Tumor Node Metastasis），着重强调肺癌胸膜侵犯在TNM分期中的作用，不论肿瘤大小，将侵犯脏层胸膜的肿瘤归为T2期[3-4]。弹力纤维（elastic fibers, EFs）是肺内支气管及肺泡结构的主要骨架[5]，当肺部发生病变时，EFs也会发生一定的改变[6]。病理上应用胸膜的EFs染色，能直观地观察肿瘤细胞是否到达或突破胸膜层，对肺癌临床分期及在肺癌治疗策略的制定和预后判断中起重要作用[7-8]。弹力纤维Gomori醛复红染色法完整过程约需时45～60分钟，较长时间的制片染色过程在与冰冻诊断及制片技术的紧急原则权衡下，各大医院常规病理工作中，肺组织的弹力纤维染色多于术后制作并诊断[9]。基于此，本文旨在探讨优化弹力纤维染色技术是否适宜在术中冰冻进行，并为术中医师的手术决策及时提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

组织标本所来源患者的诊断标准：（1）纳入标准：于2018年全年临床入院诊断为肺癌可疑（ICD-10编码C34.9001）、收治于我院胸外科、临床医师为其开具术中冰冻申请、病理肉眼取材时可见可疑肺结节≤2 cm；（2）排除标准：冰冻肉眼取材时明确未取到肺被膜、冰冻切片HE染色后镜下观察明确诊断为浸润性肺癌或为炎性病变的。2018年全年收集标本117例。男53例，女64例。年龄26～78岁，中位数为57岁。所有资料经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

采用自身前后配对设计方法，对符合上述诊断标准的组织在术中冰冻时采用优化弹力纤维染色法进行制片和病理读片诊断，术后相同组织待石蜡切片后进行弹力纤维Gomori醛复红染色制片及病理诊断。

1.2.1 取材制片过程 首先，对新鲜肺组织将其进行取材，大小1.5 cm×1.5 cm左右，厚度为3 mm，注意取材时要保证同时取到可疑肺结节于邻近肺被膜，然后使用OCT包埋剂（Optimal Cutting Temperature Compound）对其进行包埋，将其放置在LEICA CM 1950冰冻切片机中，待包埋剂稍凝固即可进行冰冻切片，切忌冻过头，对标本进行连续切片2张，厚度约在6 μm。将切片迅速放入装有AAF液（95%乙醇：40%甲醛：冰醋酸=17：2：1）的立式染缸中，固定数秒。随后将已经固定的切片使用自来水速洗，取其中一张切片滴染苏木素液1 min，接着使用浓度为1%的盐酸乙醇迅速分化。进行温水蓝化和伊红染色，使用酒精脱水、二甲苯透明化，中性树胶行封片；另外一张切片进行改良后Gomori醛复红染色。同一病例待病理医师常规全面取材镜检后挑选适宜蜡块进行术后弹力纤维染色。

1.2.2 染色过程 见表1。

1.2.3 研究中应用的试剂 弹力纤维染色试剂盒（产品编号：MST-8047/8048，批号1802068048，规格15 mL）。

1.2.4 观察指标 所有组织切片遵循三级诊断制度，由住院病理医师读片并下初步诊断，主治病理医师复片，如有疑问再由上级病理医师（副高及以上）审核。本研究中阳性指相应染色方法制片后诊断结果为浸润性，阴性指诊断结果为微浸润或原位。

1.3 统计学方法

运用SPSS 19.0软件包进行数据分析。采用配对计数资料的χ2检验进行统计学分析。将数据结果用“阳性”或“阴性”二分变量呈现，采用McNemar检验分析配对资料结果是否有差异，用Kappa值来度量测量结果的一致性。所有结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镜下观察病理特点

切片中富含弹力纤维的组织如血管、肺被膜等呈深紫色波浪状，背景呈不同程度的淡黄色，二者镜下呈像无明显分别，见图1、图2。

2.2 诊断结果

经病理学观察显示，使用术中冰冻优化弹力纤维染色，阳性患者23例，阴性94例，阳性率为19.66%。对相同组织进行术后石蜡切片弹力纤维Gomori醛复红染色，阳性患者28例，阴性患者89例，阳性率为23.93%。采用配对计数资料的χ2检验，McNemar检验结果为P=0.063，两法诊断结果无显著差异。两种方法的诊断吻合系数Kappa=0.875，P=0.000，说明两种方法的吻合度有统计学意义且较强。见表2。

3 讨论

图1 术中冰冻优化弹力纤维染色显微镜下裁图

图2 术中冰冻优化弹力纤维染色显微镜下裁图

表1 术中冰冻优化弹力纤维染色与术后石蜡切片弹力纤维Gomori 醛复红染色方法比较

表2 应用两种弹力纤维染色技术诊断肺癌浸润程度的结果描述

冰冻切片技术是一种较为常用的术中病理诊断方法，由于其检测迅速，因而能为手术操作提供较为可靠的依据，对于提高手术效果具有重要的作用[10]。冰冻切片作为一项条件因素要求严格的技术，临床和病理医师考虑术中冰冻切片诊断与术后石蜡切片诊断存在一定漏诊率，故对于肺癌患者的弹力纤维染色常规采用术后石蜡切片Gomori醛复红染色。如若将肺组织弹力纤维染色诊断结果提前至术中，将对术中医师的手术决策及患者预后产生较大临床意义。本次研究中，采用术后石蜡切片弹力纤维染色作为对比，研究结果显示同一块组织术中冰冻优化弹力纤维染色诊断结果与其无显著差异，可见术中冰冻优化弹力纤维染色诊断准确性较高。并且，从诊断结果绝对值差异上看，二者的差异存在于术中冰冻优化弹力纤维染色诊断结果为阴性，而术后石蜡切片弹力纤维染色诊断为阳性，可能与取材数量范围等原因有关。但这种漏诊情况并不影响加做术中冰冻优化弹力纤维染色对临床术中医师手术范围抉择的指导价值。

与对照组的术后石蜡切片弹力纤维Gomori醛复红染色比较，试验组的术中冰冻优化弹力纤维染色方法部分步骤时间缩减，同时镜下观察舒适，颜色清晰，界限分明，将组织弹力纤维染色成深紫色，从而判定弹力纤维的完整性、是否断裂，进而推断肺癌有无浸润[11]。二者镜下呈像无明显分别，术中冰冻优化弹力纤维染色达到理想的制片效果。我院病理科常规要求一例术中冰冻报告时限为30 min，开展肺癌术中冰冻优化弹力纤维染色能够在规定时限内报送诊断结果，在最为恰当时刻为手术医师提供诊断和手术参考依据，具有一定临床意义。

在术中冰冻切片检测中，除上述的制片质量、工作时间外，诊断结果还受检测组织、取样质量等因素影响[12]。因此，为保证术中冰冻优化弹力纤维染色诊断结果的准确性，必须强调术中肺癌组织取样的规范性，同时还要求病理医生取材、读片的质量。

综上所述，针对肺癌手术患者，保证病理切片和诊断质量前提下，采用术中冰冻优化弹力纤维染色，其准确率高，为临床医生的手术方式提供有力依据，增加手术医生信心，避免患者二次手术，提高患者预后。