2018年我国蓝舌病血清学调查及影响因素分析

王芳，肖雷，朱沛，朱建波

(1.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224； 2.开远市动物疫病预防控制中心，云南 开远 661600)

蓝舌病是由蓝舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)引起的一种通过媒介昆虫库蠓传播的非接触性病毒性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的多种动物共患传染病，我国将其列为一类动物传染病[1]。BTV 属于呼肠弧病毒环状病毒属病毒，目前已确认存在至少27 种血清型[2，3]，其中，BTV-8(蓝舌病欧洲8型)近年来曾在比利时、荷兰、法国、德国等欧洲国家暴发，引起绵羊和牛大量发病，造成了严重的经济损失。我国自1979 年在云南省师宗县首次分离出BTV[4]后，至今在全国范围内已分离到11 个血清型的BTV 毒株[5]，在我国31个省(市、自治区)都发现有蓝舌病抗体阳性动物。为进一步了解2018年蓝舌病在我国的流行分布情况，对来自重庆、新疆、吉林、湖北、内蒙古、贵州、河北、广西和云南等9个省(市、自治区)93个县(市、区、旗)的牛羊血清进行蓝舌病C-ELISA抗体检测及BTV-8型中和抗体检测。

1 材料与方法

1.1 血清样本来源

血清样品由各省(市、自治区)的动物疫病预防控制中心负责采集，送云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室-20℃保存。样品采集情况见表1。

1.2 试验试剂

BTV C-ELISA抗体检测试剂盒、BTV-8标准株均由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室提供。

1.3 BTV C-ELISA试验方法

在ELISA板中每孔分别加入10μL的待测血清、阳性血清、弱阳性血清、阴性血清(每份加2孔)，置37℃温育30min；用试剂盒提供的样品稀释液按照1:100倍稀释兔抗BTV抗体 (竞争抗体)，每孔加50μL竞争抗体，在37℃温箱里温育60min；用PBST洗液洗板2次，拍干，按1:1000稀释羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，每孔加50μL，在37℃温箱里温育30min；用PBST洗液洗板5次，拍干，每孔加入50μL底物反应液，37℃避光温育10min，每孔加入终止液50μL终止反应，15min内在酶标仪450nm波长下读取OD值。结果判定：抑制率(PI)=(阴性对照OD450平均值-样品血清OD450) / 阴性对照OD450平均值×100%,抑制率≥50%时判为抗体阳性，否则为阴性。

1.4 BTV-8标准毒株毒价测定

96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，将病毒按100-10-10倍比稀释，依次加入96孔板中，每孔加50μL，每个稀释度做8孔，吸附1h后，接毒孔中加入50μL维持液，剩余对照孔中加入100μL维持液，37℃培养5d，观察细胞病变的情况，用Reed and Mench法计算毒价。

1.5 微量中和试验

将C-ELISA阳性的待检血清做1:10倍稀释来中和100个TCID50的病毒，存在中和作用时，再对这些血清进一步稀释为1:20和1:40做微量中和试验，中和滴度大于1:40的判定为阳性。

表1 血清样本采样地点及数量统计表

2 结果

2.1 BTV C-ELISA结果

图1 各省(市、自治区)BTV血清抗体阳性率比较

对5 721份血清样本进行BTV C-ELISA抗体检测，其中1769份血清样本为BTV抗体阳性，平均阳性率为30.92%，被调查的省份均检出BTV抗体阳性样品，结果见表2。其中，以云南省的抗体阳性率最高，达75.90%，吉林省的阳性率最低，仅为4.33%，各省(市、自治区)阳性率差异明显，见图1。在所检测的样品中，云南的样品全是牛血清样品，其他省、市、自治区牛和羊血清样品都有，合计检测牛血清样品1827份，阳性率为44.12%，羊血清样品3894份，阳性率为23.73%，各省(市、自治区)牛、羊血清样品BTV抗体检测结果见表3。

表2 血清样本BTV C-ELISA抗体检测结果

2.2 中和试验定型

将1769份BTV抗体阳性的血清做微量中和试验，其中有1540份作1:10倍稀释时有中和作用，将这1540份血清进一步稀释为1:20、1:40再次进行微量中和试验，这1540份血清对BTV-8均无中和保护，全判定为BTV-8抗体阴性。

3 讨论

BTV 主要通过库蠓吸血传播，其分布受库蠓活动影响极大。库蠓孳生于水塘、沼泽、湖泊附近的草丛、树林、洞穴等避风、避光潮湿处。库蠓活动常常受环境因素的影响，特别是温度、湿度、降雨量等，有明显的季节性和地域性[6]。

表3 牛、羊血清样品BTV C-ELISA抗体检测结果

通过对2018年我国9个省(市、自治区)93个县(市、区、旗)牛、羊血清样品进行BTV C-ELISA抗体检测，平均阳性率高达30.92%。在9个省(市、自治区)都检出抗体阳性样品，在93个县(市、区、旗)检出阳性样品，表明BTV在我国的感染已相当普遍，这与我国库蠓种类多、分布广泛相对应。

此次云南省样品的BTV抗体阳性率高达75.90%，与这些样品均来源于云南南部与缅甸、老挝和越南接壤的10个边境县，而且全部是牛血清样品密切相关。云南的南部纬度低，气候高热高湿，适宜库蠓的生存、繁殖，库蠓活动频繁。同处低纬度具有相似气候特点的广西的牛血清样品的抗体阳性率也高达75%。

我国北方的河北、内蒙古和吉林等地样品的BTV抗体阳性率都不到10%，与这些地方纬度较高、冬季严寒漫长、年均气温低、库蠓活动受限有关。

新疆样品的BTV抗体阳性率也较高，其中牛的阳性率为35.23%，羊的阳性率为41.68%，这是一个值得重视的情况。新疆位于亚欧大陆深处，虽然大部分地区常年降雨量小，冬季寒冷，夏季炎热，不利于库蠓的生存繁殖。但新疆地域广阔，除有大面积的沙漠戈壁等不利于库蠓生存的环境外，也有一些森林、草原和湿地为库蠓提供了繁衍生息所需的适宜条件，这些地方也是主要的牛羊放牧场所，为BTV的传播提供了良好条件。

本研究对我国多地的牛羊进行了BTV血清学调查，覆盖我国不同气候类型地区，样本量较大，较好的反映了2018年度蓝舌病在中国的分布情况，为该病的防控提供了流行病学依据。