UPLC-MS/MS法测定新疆冷水鱼中孔雀石绿与隐色孔雀石绿

李晓岩 ，武 运，王犁烨 ，苏 敏，沈慧慧，巴哈提古丽·马那提拜

(1.新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063；2. 新疆农业大学，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】新疆冷水鱼肉质鲜美、口感独特、有较高的营养价值，是新疆特有鱼种之一，有良好的市场前景，在南北疆各地区已形成一定的养殖规模[1,2]。由于冷水鱼幼鱼感染疫病的几率比较高，常给冷水鱼养殖造成极大的损失，为了防止这类情况发生，养殖者曾用孔雀石绿(MG)来对各种鱼类和水产品进行杀菌、消毒、净化水质以及保鲜[3]。MG又称碱性绿、苯胺绿，属于合成三苯甲烷类化工染料的一种，具有高效广谱的杀菌作用[4,5]，在其进入人体后会代谢产生隐色孔雀石绿(LMG)，二者都具有高残留等毒性[6-10]。国际上将MG以及LMG列为水产养殖禁用药物[11]。2002年我国农业部也将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中[12,13]，是我国主要打击的滥用食品添加剂和违法添加非食用物质之一。但由于孔雀石绿(MG)具有明显的杀真菌作用，违禁使用孔雀石绿(MG)的现象时有发生，加大对冷水鱼等水产品的安全抽样检测力度，是重要的手段，但由于我国鱼肉中MG及其LMG代谢物残留量的检测分析方法存在操作方法繁琐，耗时长且成本较高等，建立一种高效、简便、准确、耐用、低成本的检测方法，是十分必要的。【前人研究进展】我国鱼肉中MG及其LMG代谢物残留量的检测分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)[14]、高效液相色谱法-质谱法(LC-MS)[15]、气相色谱法-质谱法(GC-MS)[16]、酶联免疫法(ELISA)[17]、表面增强拉曼光谱法[18]。【本研究切入点】GB/T19857-2005、GB/T 20361-2006 等均能测定孔雀石绿(MG)及其代谢物。但HPLC和ELISA无法提供目标化合物结构信息，GB/T19857-2005和GB/T 20361-2006中前处理操作过程耗时较长，而且目标化合物具有不稳定性需要迅速处理并进行上机测定。【拟解决的关键问题】通过优化样品预处理方法和检测条件，有效校正预处理过程中的误差和损失，简化操作步骤，降低成本，并采用内标法提高回收率，建立一种更为高效、准确、低成本的检测方法,进一步完善新技术标准。

1 材料与方法

1.1 材 料

ACQUITY UPLC-Quattro premierXETM质谱联用仪(美国Waters公司)；VORTEX-5漩涡混合器(华利达实验设备有限公司)；腕式振荡器(美国BURRELL公司)；固相萃取装置(美国Agilent 公司)；氮吹仪(美国Organomation 公司)；高速离心机(日本HITACHI公司)；Bond Elut-SCX(强阳离子交换)固相萃取柱(500 mg/3 mL)(美国Agilent公司)；DIKMA ProElut C18 (500 mg/6mL)(北京迪马科技有限公司)；Oasis HLB (500 mg/6mL)(美国Waters公司)；0.2 μm再生纤维素滤膜(美国Waters公司)。

孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氘代孔雀石绿(D5-MG)、氘代隐色孔雀石绿(D6-L MG)标准品(美国Dr公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯，Fisher 公司)；冰乙酸、无水硫酸钠(Na2SO4)、氨基(NH2)吸附剂、氨水、乙酸铵、98%甲酸：(优级纯，天津市致远化学试剂有限公司)。实验用水均为高纯水。

1.2 方 法

1.2.1 标准工作液的配制

用乙腈溶液将MG、LMG及D5-MG、D6-L MG标准品配制成浓度为100 mg/L的标准储备液，并根据需要用甲醇-水(2:8，v/v)溶液稀释成适当浓度的混合标准工作液，存储于棕色瓶中，4℃保存，有效期3个月。

1.2.2 色谱条件

Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱温35℃，样品室温度7℃；流量0.25 mL/min，进样量10 μL，流动相：A溶液为10 Mmol/L乙酸铵[含0.1%(体积分数)甲酸，B溶液为乙腈；MG和LMG药物梯度洗脱程序：0～2 min，A由60%～10%；2～5 min 10%保持3 min。5～5.5 min10%～60%；5.5 min～7.5 min 60%～60%。

1.2.3 质谱条件

表1 多反应监测扫描模式质谱参数
Table 1 Multi-reaction monitoring scan mode mass spectrometry parameters

化合物Compound母离子Parention(m/z)子离子Daughterions(m/z)锥孔电压Conevoltage(U/V)碰撞能量Collisionenergy(E/eV)孔雀石绿(MG)329.1207.7∗,312.83535,35隐色孔雀石绿(LMG)331.1239.0∗,315.83530,20氘代孔雀石绿(D5-MG)334.1317.93535氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)337.0240.03530

注：*为定量离子

Note:*is a quantitative ion

1.2.4 样品前处理

将去骨的鱼肉样品，用刀式研磨均质仪2 500 r/min粉碎至浆状

称取5.00 g试样，置于50 mL离心管中，加入适当的内标溶液和标准溶液，移取15 mL 1%冰乙酸-乙腈溶液，振荡20 min，加入6 g无水硫酸钠，涡旋1 min，4 500 r/min离心10 min，放置20 min。

1.2.5 初净化

量取7.5 mL上清液至15 mL离心管中，加入400 mg NH2，涡旋2 min，4 500 r/min离心10 min。

1.2.6 SCX 固相萃取柱净化

准确移取1.2.5中上清液6 mL于15 mL试管中，加入0.3 mL甲酸混合，为待净化液。SCX固相萃取柱净化：用2.5 mL乙腈-甲酸溶液(98：2)平衡活化。将待净化液转移至小柱中，用2.5 mL乙腈溶液冲洗试管，转移至小柱中，依次用2.5 mL丙酮溶液、2.5 mL甲醇溶液、2.5 mL乙腈溶液洗涤，将10 mL刻度试管置于固相萃取柱下，用7.5 mL氨水-乙腈(6：94)溶液洗脱，接收洗脱液。在氮气下45℃缓缓吹干，用400 μL甲醇-水(2：8，v/v)溶解残渣，涡旋振荡30 s，用0.2 μm再生纤维素滤膜过滤至1 mL全回收样品瓶中，供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择和优化

鱼肉中富含蛋白质、维生素、无机盐等营养成分，脂肪含量相对较少。乙腈能够使蛋白质变性沉淀，离心后去除；Na2SO4能吸收基质中的水分；NH2作为吸附剂能吸附基质提取液中部分脂肪和碳水化合物。用纯乙腈作为提取液，待测物的峰形不对称，灵敏度低，而在乙腈溶液中加入一定量冰乙酸后，待测物的峰形较好和灵敏度较高。由于MG和LMG在酸性环境下能够以一种稳定状态存在，分别选择浓度为0.3%、0.5%、1%的冰乙酸-乙腈溶液进行试验。试验表明，1%的冰乙酸-乙腈提取液使目标化合物的峰形和灵敏度最好。

2.2 固相萃取柱的选择

分别对DIKMA ProElut C18 500 mg/6 mL、Agilent BOND ELUT-SCX 500 mg/3 mL、Oasis HLB 500 mg/6 mL三种固相萃取柱进行了选择。试验表明，SCX 500 mg/3 mL固相萃取柱能够较好的保留目标化合物，并能够使样品中的杂质与目标化合物完全分离，能够准确定量，满足回收率的要求。

2.3 色谱条件的选择和优化

实验比较了Acquity BEH C18 (2.1 mm×50 mm.1.7 μm)、ODS C18 Hypersil 5 μm，250 mm × 4 mm色谱柱的分离情况，前者对MG和LMG能完全分离,保留时间具有较好的稳定性，对实际样品检测适用性更好，同时色谱图基线分离，色谱峰型对称，杂峰干扰少。MG、LMG的保留时间分别为1.58 min、3.02 min。图1

2.3.1 流动相的选择

目标化合物的测定是采用正离子模式，用极性色谱柱C18来分离，通常使用乙腈溶液和甲醇溶液作为有机相，乙酸铵或甲酸铵、乙酸或甲酸溶液作为水相。研究发现，当使用10 mmol/L乙酸铵[含0.1%(体积分数)甲酸]溶液和乙腈溶液作为流动相时，待测物的灵敏度和峰形都比较好。选择流动相10 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)溶液为A，乙腈溶液为B。

2.4 质谱条件的优化

分别用0.5 mg/LMG、LMG的单一标准溶液进样，通过ESI()模式进行一级质谱全扫描，能够得到每种目标化合物的母离子，再对其子离子进行全扫描，以MRM模式进行检测分析。通过调节锥孔电压和碰撞能量，使其特征离子响应值达到最高，最终确定每种目标化合物的质谱检测参数。表1

2.5 定性及定量

对样品目标化合物进行检测时，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶液的保留时间一致(变化范围为±2.5%之内)；检测到样品质谱图中所选择的离子均出现，同时所选择的离子丰度比与标准溶液中的离子丰度比一致，最大允许相对偏差不得超过文献[19]中规定的范围，可以确定样品中存在目标化合物，采用内标法定量。

2.6 线性关系及检出限

分别移取适量的MG、LMG及内标物标准工作溶液，配制成目标含量为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的标准曲线，其中内标物含量为20 μg/L，上机测定。以目标化合物峰面积对内标物峰面积之比为纵坐标Y，以目标化合物相应的添加含量(μg/kg)的峰面积对内标物峰面积之比为横坐标X，两者呈线性关系。

图1 MG及D5-MG和LMG及D6-MG标准溶液谱图
Fig. 1 MG and D5-MG,LMG and D6-MG standard solution spectra

检出限(LOD)为特征离子色谱峰的信噪比(S/N)大于3，定量限(LOQ)为(S/N)大于10，得到MG、LMG的LOD为0.6 μg/kg，LOQ为2.0 μg/kg。表2

表2 孔雀石绿及隐色孔雀石绿线性范围、线性方程、相关系数
Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient of malachite green and leuco malachite green

化合物Compound线性范围Linearrange(μg/L)线性方程Linearequation相关系数Correlationcoefficient(r2)孔雀石绿(MG)5.0～100.0Y=2.76231X+0.2410270.9997隐色孔雀石绿(LMG)5.0～100.0Y=0.75473X+0.9260830.9992

2.7 回收率与精密度

以鱼肉为样品(实测值为未检出)，做3个水平的添加回收试验分别为2.0 、5.0 和10.0 μg/kg，每组试验重复6次 (n=6)。

MG和LMG的平均回收率分别为88%～105%和85%～110%，相对标准偏差RSD均为2.2%～15.3%。该方法回收率和精密度符合国内外标准要求，该方法准确具有可行性。表3

表3 孔雀石绿、隐色孔雀石绿回收率及精密度(n=6)
Table 3 Malachite green, leuco malachite green recovery and precision (n=6)

化合物Compound2.0μg/kg5.0μg/kg10.0μg/kg回收率Recoveryrate(%)相对标准偏差RSD(%)回收率Recoveryrate(%)相对标准偏差RSD(%)回收率Recoveryrate(%)相对标准偏差RSD(%)孔雀石绿(MG)882.2922.81052.3隐色孔雀石绿(LMG)853.79711.711015.3

3 讨 论

根据鱼肉样品基质的特点以及MG和LMG的相关物理化学性质，采用1%冰乙酸-乙腈溶液提取，氨基及SCX(强阳离子交换)固相小柱净化，C18 色谱柱分离，电喷雾串联四极杆质谱的多反应监测扫描模式(MRM)进行检测，并采用内标法定量。实验MG和LMG在鱼肉中低、中、高 3水平添加下的回收率分别为88%～105%和85%～110%，相对标准偏差(n=6)为2.2%～15.3%。MG和LMG在鱼肉中的定量限为 2.0 μg/kg。为快速检测新疆冷水鱼中MG及LMG含量提供方法支持。

4 结 论

该检测方法与传统检测方法相比，前处理步骤少，试剂用量大为减少，操作简单，检测速度快，具有更高效、更准确且回收率高、低成本的特点。实验MG和LMG在鱼肉中低、中、高 3水平添加下的回收率分别为88%～105%和85%～110%，相对标准偏差(n=6)为2.2%～15.3%。MG和LMG在鱼肉中的定量限为 2.0 μg/kg。在检测冷水鱼等水产品中孔雀石绿(MG)和隐色孔雀石绿(LMG)的实际应用中，效果良好。