离子色谱法测定马来酸阿法替尼中杂质二甲胺的含量

周黎明，尹宁宁，迟双双

(1.山东省食品药品审评认证中心，山东 济南 250014；2.山东亨利医药科技有限责任公司，山东 济南 250000)

阿法替尼(Afatinib或BIBW2992)是由德国勃林格殷格翰公司研发的多靶点抗癌新药， 2013年7月美国食品药品监督管理局(FDA)批准Giotrif(阿法替尼片)用于表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的晚期(转移性)非小细胞肺癌(NSCL)患者的治疗，阿法替尼片剂的主药成分为阿法替尼马来酸盐。Giotrif是酪氨酸激酶(TKI)受体的不可逆抑制剂。它与ErbB家族成员EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB1)、ErbB3和ErbB4形成的所有同、异二聚体共价结合并阻断信号传导，受体突变和/或扩增引起的异常ErbB信号传导和/或受体配体过度表达都可导致恶性表达[1-2]。阿法替尼目前被作为EGFR突变的一线治疗药物[3-7]。EGFR 基因突变可通过FDA 批准的诊断试剂进行检测[8]。即使EGFR和HER2靶向治疗失败，阿法替尼仍是这一亚组患者的潜在新型治疗选择[5]。

二甲胺是一种低分子有机胺，广泛存在于自然环境和水产品中，研究表明，二甲胺是对人体有毒的化合物，对眼和呼吸道有很强的刺激作用。眼睛接触二甲胺可引起角膜浑浊、损伤，皮肤接触液态二甲胺会引起坏死，在一些亚硝基和含硝基化合物存在下二甲胺易形成致癌物质N-亚硝基化合物[9]。马来酸阿法替尼的降解产物中含有二甲胺，为保证用药安全，需对马来酸阿法替尼中二甲胺进行限量考察。国内外药典暂未收载阿法替尼及其制剂的质量标准，目前测定二甲胺的方法主要有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)、毛细管电泳法及离子色谱(IC)法等[10-13]，各方法均有不同的适用范围。因此，本文根据二甲胺的特性，首次建立了IC法测定马来酸阿法替尼中二甲胺的残留量的方法，为马来酸阿法替尼及其制剂的质量控制以及评价其质量的一致性提供可参考的依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂 Dionex ICS-1600离子色谱仪，电导检测器； Mettler Toledo XPE205电子天平(十万分之一)；Mili-Q超纯水仪；二甲胺盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99.0%)；甲磺酸(阿拉丁，纯度≥99.5%)；实验用水为超纯水；铵离子(国家标准物质溶液，1.0 g·L-1)；钾离子(国家标准物质溶液，1.0 g·L-1)。

1.2 试验溶液的配制

1.2.1 对照品溶液的配制 取二甲胺盐酸盐对照品约18 mg(相当于二甲胺10 mg)，精密称定，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为二甲胺对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的配制 取马来酸阿法替尼适量(相当于阿法替尼10 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.3 系统适用性溶液的配制 取二甲胺盐酸盐、氯化钾、氯化铵适量，用水制成每1 mL中约含二甲胺、钾离子和铵离子各2 μg的溶液，作为系统适用性溶液。

1.3 色谱条件 照离子色谱法(《中国药典》2015年版0513离子色谱法)测定，用阳离子交换色谱柱(IonPac CG12A，250 mm×4 mm适用)，以10 mmol·L-1甲磺酸溶液为流动相；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测，检测器温度35 ℃；进样量20 μL。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验 取空白溶剂水、系统适用性溶液，照“1.3”项下色谱条件注入离子色谱仪，记录色谱图，结果表明各离子间分离度均符合要求(见图1～2)。

2.2 专属性试验 考虑到样品中的其他常规离子可能会干扰测定，作者将与二甲胺离子较难分离的Na+、NH4+、K+分别注入离子色谱仪，记录色谱图，结果见图3。

2.3 线性关系及范围试验 分别配制浓度为0.020 9、0.104 5、0.209 0、0.522 5、1.045、3.135 μg·mL-1的供试品溶液，分别精密量取20 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图，结果见表1。

表1 线性关系试验结果

以浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归，得线性回归曲线方程为：A=91 346C-2 341.2，r=1.00(n=6)。二甲胺溶液的浓度在0.020 9～3.135 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好，该线性范围涵盖二甲胺检测标准限度和检测定量限。

2.4 定量限与检测限 逐步稀释对照品溶液(0.522 5 μg·mL-1)，以信噪比约为10∶1，为定量限；以信噪比约为3∶1，为检测限。试验结果表明该方法的定量限为0.4 ng，相当于供试品进样浓度的0.002%；检测限为0.16 ng，相当于供试品进样浓度的0.000 8%。

2.5 重复性 精密称取马来酸阿法替尼影响因素试验(光照10 d，已降解出一定量的二甲胺)样品适量(相当于阿法替尼10 mg)，精密称定，置10 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行制备6份。精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果二甲胺含量的平均值为0.06%(正常样品二甲胺含量为0.01)，RSD为0.18%(n=6)，结果表明方法的重复性良好。

2.6 仪器精密度 精密量取线性供试品溶液(0.522 5 μg·mL-1)20 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图，连续进样6针，峰面积的平均值为43 985，RSD为0.59%(n=6)。

2.7 准确度试验 供试品贮备液：精密称取马来酸阿法替尼741.56 mg(以阿法替尼计约500 mg)，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为贮备液。

二甲胺对照品溶液：精密量取盐酸二甲胺对照品约18.09 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为二甲胺对照品贮备液；精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(浓度约为0.5 μg·mL-1)。

供试品溶液：量取上述二甲胺对照品贮备液(浓度：100.02 μg·mL-1)25.00 mL，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别量取0.80、1.00、1.20 mL各3份，分别置50 mL量瓶中，向其中各加入供试品贮备液10 mL，再加水稀释至刻度，摇匀，作为回收率供试品溶液。

样品准确度测定的平均回收率为98.91%，RSD为0.91%(n=9)，结果见表2，由以上结果可知该方法的准确度良好，测定方法准确可靠。

2.8 耐用性 精密量取上述“3.1”项下系统适用性溶液20 μL，分别调整甲磺酸溶液浓度、色谱柱柱温、流速等条件，依法测定，考察铵离子、钾离子与二甲胺离子的分离度，结果见表3。

耐用性试验结果表明，流动相的流速、甲磺酸浓度及柱温在微小范围内变动，对二甲胺及相近离子的测定无影响，表明该方法耐用性良好。

2.9 供试品溶液的稳定性试验 取供试品溶液(0.500 1 μg·mL-1)，分别于配制后0、2、4、8、16、24 h，精密量取20 μL注入离子色谱仪，记录色谱图及峰面积，结果供试品溶液中二甲胺离子峰面积在24 h内的RSD为1.78%(n=6)，表明供试品溶液24 h内的稳定性良好。

表2 准确度试验结果

表3 耐用性试验结果

3 结论

3.1 空白溶剂中存在微量钠离子，可能来源于配制流动相及溶剂过程中的玻璃容器，但不干扰二甲胺离子的检测。

3.2 本方法通过对二甲胺的专属性、线性与范围、精密度及准确度等方法学验证试验研究，说明该方法能够准确可靠地测定马来酸阿法替尼中杂质二甲胺的含量。