基于发酵过程的淡豆豉6种黄酮类成分质量控制研究

李鸷，曹冬英，许文，褚克丹，隋利强，徐伟

(福建中医药大学药学院，福建省中药炮制技术传承基地，福建 福州 350122)

淡豆豉是以豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]为主料，以桑叶、青蒿为辅料经过发酵加工而成的制品。性苦、辛，凉。归肺、胃经。中医理论认为淡豆豉具有解表，除烦，宣发郁热的功效，可用于感冒，寒热头痛，烦躁胸闷，虚烦不眠的症状[1]。淡豆豉主要活性成分为黄酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纤溶酶和挥发性等化合物[2-6]。其中，黄酮类成分中的大豆苷具有明显的抗骨质疏松作用[7]，黄豆黄苷具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[8]，染料木苷具有抗肿瘤和抗氧化活性[9]，大豆苷元具有显著的抗菌活性和降血糖作用[10-11]，黄豆黄素具有促成骨细胞增殖[12]和抗氧化能力，染料木素也具有明显抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化和改善更年期症状等药理活性[13]。淡豆豉中的黄酮类成分被认为是其主要活性成分，其分为游离型苷元和结合型糖苷两类，本试验对市场上购买及企业收集的淡豆豉的6种黄酮类成分的含量进行比较，建立能同时测定其中多种指标成分的方法，对于其质量控制和确保疗效具有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260 型高效液相色谱仪(美国Angilent公司)；CPA225D 型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E 台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药 对照品大豆苷(批号：MUST-16031507)、黄豆黄苷(批号：MUST-17032503)，染料木苷(批号：MUST-16021802)、大豆苷元(批号：MUST-17101202)、黄豆黄素(批号：MUST-17092210)、染料木素(批号：MUST-15090908)均购自成都曼思特生物科技有限公司，以上标准品纯度均大于98%。淡豆豉样品(编号为S1～S13)和淡豆豉原料黑豆(编号为S14)分别在市场和企业中收集，S1～S14信息详见表1。甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；甲酸为色谱纯(上海阿拉丁试剂有限公司)，其余试剂均为分析纯。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%～5% A；5～8 min，5%～30% A；8～15 min，30%～40% A；15～20 min，40%～60% A；20～30 min，60%～70% A；30～33 min，70%～5% A；33～38 min，5%～5% A)，柱温30 ℃，流速0.8 mL·min-1，进样量10 μL，检测波长254 nm。在此色谱条件下6种对照品理论板数均大于5 000，色谱峰对称性良好(见图1)。

A.混合对照品；B.供试品 1.大豆苷；2.黄豆黄苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黄豆黄素；6.染料木素

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密取大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素对照品适量，精密称定，加入甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为1.056、1.112、0.968、1.024、0.134和1.024 mg·mL-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得大豆苷52.8 μg·mL-1、黄豆黄苷55.6 μg·mL-1、染料木苷48.4 μg·mL-1、大豆苷元51.2 μg·mL-1、黄豆黄素53.6 μg·mL-1和染料木素51.2 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取淡豆豉粉末约2 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率250 W，频率50 kHz)，放冷，再次称重，甲醇补足减失重，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3 线性范围考察 取大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的混合对照品溶液，用50%甲醇稀释配制为不同梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程和线性相关系数r，结果见表2。

表2 淡豆豉中6种分析物的线性范围考察

2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，1 d内连续进样6次，计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素峰面积的RSD分别为0.79%、0.83%、1.11%、1.31%、0.96%、0.73%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取编号为S12的淡豆豉粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24 h按“2.1”项下测定大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的峰面积，结果RSD分别为1.11%、2.89%、1.63%、0.87%、1.06%、1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验 精密称取同一批淡豆豉粉末(编号为S12)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，带入标准曲线计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的平均含量分别为17.62、27.46、57.07、372.38、129.74、311.18 μg·g-1，RSD分别为1.23%、1.42%、1.78%、1.18%、2.99%、1.16%，结果表明方法重复性良好。

2.7 回收率试验 取重复性试验同批次淡豆豉粉末约1 g，精密称定，平行6份，每份分别精密加入近似等量的6种对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算各个化合物的回收率和回收率的RSD结果见表3，结果表明该方法回收率良好。

2.8 耐用性试验

2.8.1 改变色谱柱 取淡豆豉粉末(编号为S12)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下以不同色谱柱：Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo Betasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)进样测定，记录峰面积并计算6种分析物的含量，结果表明本色谱条件在一定色谱柱变动情况下耐用(见表4)。

表3 淡豆豉6个分析物的回收率试验结果(n=6)

2.8.2 改变流动相pH 取淡豆豉粉末(编号为S12)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。在甲酸体积分数为0.05%、0.10%、0.15%情况下，按“2.1”项下测定6种分析物的含量，结果表明本色谱条件在一定流动相pH值变动情况下耐用(见表4)。

2.8.3 改变流速 取淡豆豉粉末(编号为S12)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件以不同流速(0.6、0.8、1.0 mL·min-1)进样测定，记录峰面积并计算6种分析物的含量，结果表明本色谱条件在一定流速变动情况下耐用(见表4)。

表4 耐用性试验结果

2.8.4 改变柱温 取淡豆豉粉末(编号为S12)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件以不同柱温(25、30、35 ℃)进样测定，记录峰面积并计算6种分析物的含量，结果表明本色谱条件在一定柱温变动情况下耐用(见表4)。

2.9 样品含量测定 取编号为S1～S14的样品粉末，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定不同编号的粉末，计算各样品中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果(μg·g-1)

注：“-”表示未检出

3 讨论

检测波长的选择，通过对6种分析物进行DAD全波长扫描，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的最大吸收波长分别为250、258、260、248、257、260 nm，综合6种黄酮类成分在254 nm处均有良好的紫外吸收。因此，选择254 nm作为检测波长。

流动相选择，分别比较了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系统及其不同比例梯度洗脱效果，结果发现用乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱时，黄豆黄苷不能出峰，其他色谱峰重叠，而用甲醇-水梯度洗脱时，6种成分峰形不佳，改用甲醇-0.1%甲酸水溶液洗脱时，6种成分的分离效果明显改善，且峰形较好，基线稳定。故最后采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为色谱流动相。

通过分析方法学的验证，本试验验证了该方法的精密度、稳定性、重复性、线性范围和加样回收率等均符合分析要求。最后通过对不同来源样品的含量测定，结果表明，市场上收集淡豆豉的成品与企业生产的相比，其黄酮类成分含量普遍偏低，这可能市场上销售的部分淡豆豉可能省略了再闷过程，从而使产品质量较差。且不同来源淡豆豉黄酮类单体成分的含量差别也较大，推测与药材的生长环境、炮制加工方法的不同有关。此外，通过对福建咸康药业有限公司收集的原料黑豆和淡豆豉成品研究发现，淡豆豉中苷元成分的含量显著增加，糖苷成分明显减少，提示淡豆豉的炮制存在由苷向苷元转化的过程。说明大豆经炮制后，糖苷配基解离，得到游离型的苷元，其生理活性增强，从而使淡豆豉的药用价值得到充分体现。

根据耐用性试验要求，我们针对其进行了不同品牌色谱柱、不同流动相pH、不同流速及不同柱温的考察。结果表明，不同色谱条件下6种分析物的含量具有良好的重现性，RSD小于1%。色谱条件在一定范围内变化对试验结果影响较小，表明方法耐用性良好。

综上所述，本试验所建立的高效液相色谱(HPLC)法同时测定淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素含量的方法操作简便、稳定、准确且可行，可以为淡豆豉质控的提升提供参考，进一步为淡豆豉的炮制化学、炮制发酵机制和发酵产物的活性评价奠定基础。