PHC患者血清mir-355的表达水平变化及与肿瘤病理学特征的相关性

王晓，马慧，张卫卫

(洛阳市中心医院肝胆一区，河南 洛阳 471001)

原发性肝癌(primary liver cancer，PHC)的发生率具有显著的上升趋势，流行病学研究证实，PHC的年平均发病率可达283～459/10万人左右[1]。临床上PHC的发生能够导致患者总体生存时间的下降，影响患者的5年生存率等预后指标[2]。

在探讨PHC发病机制的过程中可以发现微小RNA水平的改变，能够通过影响肝脏上皮细胞的生物学特征，进而参与到早期PHC的发生过程中。微小RNA-355(mir-355)是微小RNA家族的重要成员，mir-355的表达浓度的维持能够有效稳定癌细胞的增殖速度，抑制癌细胞对于血管内皮细胞的粘附和侵袭过程[3]。同时mir-355的表达，还能够提高癌细胞的分化成熟能力，降低癌细胞的低分化或者中低分化的风险[4]。部分研究者探讨了mir-355在胃癌或者结直肠癌患者中的表达情况，认为mir-355的表达下降能够显著促进胃癌等恶性肿瘤的发生[5]。为了深入揭示mir-355的表达与PHC的关系，从而为临床上PHC患者的诊疗提供理论基础，本次研究取我院2015年1月至2016年12月经病理学明确诊断的90例PHC患者，探讨了mir-355的表达及其与患者临床病理特征的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院2015年1月至2016年12月经病理学明确诊断的90例PHC患者(PHC组)、慢性乙肝后肝硬化患者90例(对照组(、90例健康体检志愿者(健康组)。PHC组，年龄44～79岁，平均为60.5±11.5岁，男52例、女38例，其中肿瘤单发66例、多发24例，病灶直径＞5cm 49例、≤5cm 41例，分化程度：高分化22例、中分化38例、低分化30例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期30例、Ⅳ期5例。对照组，年龄39～76岁，平均为58.0±10.5岁，男49例、女41例。健康组，年龄 41～79岁，平均为 57.5±13.2岁，男 47例、女 43例。三组研究对象的年龄、性别比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。纳入标准：(1)PHC患者的诊断标准参考《原发性肝癌诊疗规范2015年版》、慢性乙肝或慢性乙肝后肝硬化患者的诊断标准参考 《内科学》人民卫生出版社中的标准；(2)PHC的确诊以病理学结果作为金标准；(3)本研究获得医学伦理委员会的批准。排除标准：(1)重度营养不良；(2)具有放化疗病史；(3)精神疾病患者；(4)免疫疾病；(5)类风湿性关节炎疾病。

1.2 指标检测方法 mir-355的检测：采集患者空腹血5ml，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃ 冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)，反复一次洗涤 RNA，弃上清，在管底部可见一乳白色小沉淀物，加入 1 ml75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其终浓度均为 20pmol/ul，制备反应体系，RT-PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2 min共40个循环；循环完毕后68℃延伸7min。

2 结果

2.1 三组研究对象血清mir-355水平比较 PHC组、对照组的血清中mir-355水平显著低于健康组(P＜0.05)，PHC组的血清中mir-355水平显著低于对照组(P＜0.05)；见表 1，图 1。

表1 三组研究对象血清mir-355水平比较()

表1 三组研究对象血清mir-355水平比较()

组别 n mir-355（2-△△ct） F 值 P 值PHC组对照组健康组90 90 90 1.14±0.40 1.69±0.50 2.26±0.59 27.594 0.000

图1 血清mir-355水平扩增电泳图

2.2 不同病理学特征的PHC患者血清mir-355水平比较 病灶多发、病灶直径≥5cm、发生脉管侵犯、低分化、TNM分期(Ⅲ期+Ⅳ期)的PHC患者血清mir-355水平低于病灶单发、病灶直径＜5cm、未发生脉管侵犯、高中分化、TNM分期(Ⅰ期+Ⅱ期(的PHC患者(P＜0.05)；不同AFP水平PHC患者的血清mir-355水平差异无统计学意义(P＞0.05)；见表2。

表2 不同病理学特征的PHC患者血清mir-355水平比较()

表2 不同病理学特征的PHC患者血清mir-355水平比较()

因素 n mir-355(2-△△ct) t值 P值AFP(μg/L)≥20＜20病灶数目单发多发病灶直径(cm)≥5＜5脉管侵犯是 否分化程度高+中低分化TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期+Ⅳ期62 28 66 24 49 41 38 52 60 30 55 35 1.10±0.34 1.24±0.37 1.26±0.38 0.81±0.26 0.91±0.39 1.35±0.33 0.83±0.27 1.31±0.38 1.20±0.38 1.01±0.35 1.33±0.35 0.86±0.37-1.759 5.354-5.712-6.651 2.294 6.074 0.082 0.000 0.000 0.000 0.024 0.000

3 讨论

PHC的病情进展相对较为隐匿，虽然早期可表现为恶心呕吐等临床症状，但疾病总体的早期诊断水平较低[6]。同时PHC的手术治疗或者放化疗治疗后，患者的病死率或者生存时间等指标均无明显改善[7,8]。一项包含了334例样本量的多中心PHC临床研究显示，PHC的早期诊断水平不足55%，治疗后的病情缓解率不足40%，无瘤生存时间不足48个月[9]。本次研究通过对于相关分子生物学水平的相关研究，不仅能够为揭示PHC的发病机制提供参考，同时可以对于疾病的诊断提供潜在的临床指标。

微小RNA在恶性肿瘤的发生过程中发挥了重要的作用，其能够参与到肿瘤细胞的代谢、细胞周期调控及细胞凋亡等过程中。mir-355水平的改变对于肿瘤信号通路的抑制，能够减少癌细胞转录调控因子的激活，降低癌细胞DNA的扩增速度。mir-355能够促进癌细胞膜表面糖蛋白配体的沉默，降低细胞周期调控依赖性蛋白激活的转录水平，稳定G1/S期比例，降低G1期细胞的总数[10]。近年来相关基础方面的研究显示，mir-355其表达浓度的改变能够通过稳定上皮细胞的极性，抑制癌细胞上皮-间质转化过程，从而降低了癌细胞的扩散风险[11]。部分研究者以及探讨了mir-355的表达与直肠癌或者结肠癌的关系，认为mir-355的表达缺失是导致恶性肿瘤放化疗治疗敏感性下降的重要因素[12]。虽然有部分研究者探讨了mir-355在PHC患者中的表达情况，但相关研究仅限于流行病学研究的探讨，未深入探讨mir-355的表达与PHC患者临床病理特征和甲胎蛋白(AFP)的关系。

对于mir-355的表达分析研究发现，mir-355在肝癌或者肝硬化患者中的表达浓度均明显的下降，低于正常对照组人群，差异较为明显，特别是在PHC组患者中，mir-355的表达下降更为明显，提示了mir-355的表达下降能够影响PHC的发生过程。通过汇集不同的相关文献，笔者认为这主要考虑与mir-355的下列几个方面的作用有关[13]：(1)mir-355的表达下降能够导致肝脏癌细胞变形能力的上升，癌细胞对于临近正常肝脏小叶组织的浸润能力明显的增强；(2)mir-355的表达下降导致癌细胞周期调控的异常，癌细胞快速跨越G0期的能力明显增加。余斌等[14]研究者也发现，在PHC患者中，mir-355的表达浓度可平均下降35%以上，特别是在合并有明显的高肿瘤负荷表现或者远期病死率较高的患者中，mir-355的表达浓度的下降更为明显。对于mir-355的表达与PHC患者临床病理特征的分析研究可见，发生了脉管浸润、癌细胞分化程度较差或者临床分期较晚的患者中，mir-355的表达浓度可显著的下降，提示了mir-355的表达与PHC患者的临床病理特征具有密切关系，这主要由于mir-355的表达下降能够影响到癌细胞的分化成熟过程，导致癌细胞对于腹腔内临近脏器组织损伤风险的增加；在肿瘤直径较大或者多发性的肿瘤患者中，mir-355的表达浓度明显的下降，mir-355与PHC患者一般性临床资料特征的关系，考虑与mir-355的表达缺失能够影响到癌细胞的增殖过程，从而促进肿瘤体积的增大[15]。AFP是PHC相对特异性的肿瘤指标，AFP的上升对于PHC的诊断和治疗预后的评估均具有重要的意义，本次研究并未发现AFP的表达水平与mir-355的关系，提示mir-355的表达缺失并不能影响到癌细胞对于AFP的释放，但部分研究者认为在AFP较高的患者中，mir-355的表达浓度可进一步的下降，本次研究并未相关结论，考虑可能与PHC患者的基础性病情差别较大或者AFP的检测时机的不同有关。