利用流式细胞仪鉴定槭树染色体倍性的方法探究

柳 斌，任红剑，李美荣，贾冰玉，黄 华

（1.宁阳县生态林业发展中心，山东 泰安 271400；2.宁阳县农业农村局，山东 泰安 271400；3.山东农业大学林学院，山东 泰安 271000）

多倍体植物通常表现有茎干粗壮、叶片大而厚和抗逆性强等特点，特别是在生长速度、遗传特性等方面具有明显优势[1]。植物多倍化进程当中，基因表达传控出现巨大变化[2]，这为植物变异进化提供了有利条件，植物多倍体诱导是今后植物遗传变异研究的重要育种手段。

流式细胞仪可以定量测试某一植物细胞中RNA、DNA的含量，与传统的组型分析法染色体计数法相比，该方法能够较为迅速准确地鉴定植物倍性[3]。在植物遗传育种研究过程中，流式细胞仪的检测不受植物取材部位与时间限制，极为方便简单，精准度较高[4]。某一植物多倍体一旦产生后能够增加该类群植物的遗传进化多样性，为培育植物新品种和育种研究提供重要参考。

三角枫（Acer buergerianum Miq.）和元宝枫（Acer truncatum Bunge）都属槭树科槭树属落叶乔木，都是我国自然分布广泛的优良乡土观赏树种[5]。有关槭树类植物多倍体的报道较少，仅有山东农业大学丰震教授的研究团队，对以三角枫为代表的槭树植物进行过多倍体诱导试验[6]，并获得三角枫多倍体的植物新品种，命名为“兴旺”。

本试验研究利用流式细胞仪，以元宝枫、三角枫等槭树植物叶片为试验材料，探究快速鉴定槭树科植物倍性的步骤和方法。该试验探究为开展槭树科植物多倍体育种奠定基础，以期为槭树科植物多倍体育种工作能够取得突破性进展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试三角枫材料：三角枫1号和三角枫2号，均取自山东省高桥国有林场苗圃基地内的槭属资源圃。两个三角枫无性系的选育方法：在槭属资源圃内发现两株生长特征比较奇特的单株，之后用普通三角枫实生苗作砧木，通过嫁接方式培育得到三角枫1号和2号。

供试元宝枫材料：元宝枫A号、元宝枫F号，取自山东胜鑫园林苗圃地内。两个元宝枫无性系的选育方法：通过多年野外调查和选择，确定了一株秋叶红色明显且时间较长的优良母株，从其母株上采种、播种繁殖形成 A、B、C、D、E、F、G 号 7 个家系，而本试验中所采用的元宝枫A号是从A号家系单株嫁接繁殖得到的3年生无性系苗。元宝枫F号同样是从F号家系单株经过上述过程繁育而来。元宝枫A号和元宝枫F号是其中两个形态及秋季叶色差异显著的单株，其中，元宝枫A号秋季叶色表现为鲜红色，叶柄较短，树冠宽广；元宝枫F号秋季叶色表现为金黄色，叶柄长而纤细较柔软，树冠窄。嫁接所用的砧木是同批次得到的元宝枫实生苗，种子采自于山东省高桥国有林场10年生以上的元宝枫大树。

叶片采自于2018年9月份，每个系号分别采集叶片。采集时，用酒精轻微擦洗后用锡箔纸包好后，立即放入液氮中带至山东农业大学实验室。从液氮中取出后迅速放入-80℃冰箱保存备用。

1.2 槭树外观形态测定

使用游标卡尺测量4个系号的槭树叶片长度、宽度和叶柄长度，用测杆和围尺分别测量其树高和胸径。

1.3 槭树DNA含量的测定

1.3.1 溶液配备

溶液Ⅰ：将4.2 g浓度为0.1 mol/L的柠檬酸和1 ml的0.5%的吐温20混合，将其定容至200 mL，在4℃下保存备用。

溶液Ⅱ：将28.65 g浓度为0.4 mol/L的磷酸氢二钠，PI 20 mg定容至200 mL，在室温下保存备用。

1.3.2 材料处理与检测

分别取两个三角枫和元宝枫的无性系各少量的叶片，放在4个不同的干净培养皿内并标号1、2、3、4 号（1、2、3、4 号分别代表三角枫 1 号、三角枫 2号、元宝枫A、元宝枫F。要注意避开叶脉的干扰）。用移液枪取 200μL溶液Ⅰ和600μL溶液Ⅱ分别加入4个培养皿，在此裂解液中用锋利的双面刀片切碎叶片。之后静置10min左右，使其裂解。（一般嫩叶只需3-5min）

裂解之后的叶片溶液经过尼龙筛网过滤，将所得滤液在13000 r/min的条件下离心30s，4个培养皿分别过滤到4个不同的Eppendorf管中，分别标号 1、2、3、4 号。 之后加入 PI（染料）使染料和叶片溶液整个的溶液浓度大约维持在0.1mol/L左右。

4 个不同的 Eppendorf管中标号的 1、2、3、4 号对应是三角枫1、三角枫2、元宝枫A号、元宝枫F号，分别用1 mL移液枪取上滴0.1mL处的液体，加入流式细胞仪内进行检测。

1.4 数据处理

运用Excel 2007和SPSS 22软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 流式细胞仪检验结果

经过流式细胞仪检测分析后，得到4个槭树品系的图像（图1-图4）如下：元宝枫的活细胞数所占比例是优于三角枫的，具体活细胞所占比例的关系是：三角枫1号＜三角枫2号＜元宝枫A号＜元宝枫F号。而DNA含量方面三角枫高于元宝枫。尤其三角枫1号，DNA含量较高。由于采集叶片时间正处秋季，叶子的纤维素含量过高，虽然采集的是嫩梢基部的绿叶，但是总体效果不是太好，黑色杂质部分较多（主要是由于季节的原因）。

图1 三角枫1号检测图像

图2 三角枫2号检测图像

图3 元宝枫A号检测图像

图4 元宝枫F号检测图像

2.2 形态特征比较

三角枫1号枝干高大挺拔，叶片肥厚宽大，当年新生枝条鲜绿色；三角枫2号，树冠分散，叶片、树高等形态数据明显小于三角枫1号；元宝枫A号和元宝枫F号形态数据较为相似，树高有所差距，叶片表现形态基本一致，叶长、叶宽在60 mm和90 mm左右。四个槭树品系的叶片形态学比较结果如表1所示。两个三角枫品系间差异显著。

表1 形态特征比较

3 讨论与结论

流式细胞仪能够自动快速地进行植物的倍性检测[7-8]，流式细胞仪进行植物倍性鉴定的数据真实可靠，多次得到试验证实。本文用流式细胞仪鉴定两个三角枫品系和两个元宝枫品系，通过试验数据分析，得到春季嫩叶的叶尖是最优检测时间和位置；最优裂解液是0.1 mol/L的柠檬酸和0.5%的吐温20制成的混合液取200ul，再加入0.4 mol/L的磷酸氢二钠600ul。检测得到的其活细胞数和DNA含量均差异差异较为显著，具体活细胞所占比例的关系是：三角枫1号＜三角枫2号＜元宝枫A号＜元宝枫F号；DNA含量方面三角枫高于元宝枫。

多倍体个体在植物界中广泛存在，这是植物趋于进化变异、适应新环境的重要途径之一[9]。多倍体育种在林业植物新品种发展中具有巨大潜力，林木多倍体在长势和抗逆性方面均优于普通种质[10]。多倍体研究当中，对形态学的比较分析是非常必要的[11]，本试验就是对各槭树植物形态进行测量比较的，得到结果，三角枫1号的形态学数据明显大于三角枫2号，其枝干高大挺拔，叶片肥厚宽大；元宝枫A号和元宝枫F号形态整体较为相似。

槭树植物作为传统的彩叶树种[12-13]，社会需求量越来越大，其育种繁殖研究肯定会成为热点。槭树多倍体研究为槭树植物新种质提供了理论基础，会加速槭树植物新品种的培育与繁殖。总之，流式细胞仪是快速便捷鉴定植物倍性的现代化科技手段，本试验通过用槭树科植物对该类群进行倍性检测，是对该领域一个新的探索，同时也为槭树科植物多倍体育种提供了一定的方向和目标。