喷射参数对微滴喷射细胞效果的影响*

喻梓瑄，张宵敏，周新丽

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

1 引 言

目前，玻璃化法的应用范围主要是卵母细胞和胚胎的保存，保存过程利用多种形式的冷冻载体，如电镜铜网法(EMG)[1]，开放式拉伸麦管法(OPS)[2]，半麦管法(Hemi-straw)[3]，Cryotop 法[3]，石英毛细管法(QMC)[4]，冷冻环法(Cryoloop)[3]等。有载体的微滴玻璃化，每次仅可对少量的细胞进行玻璃化保存，且保护剂的加载去除过程操作复杂。微滴喷射玻璃化保存，是把含有细胞的悬液用喷嘴装置吹打成无序状态且十分微小的液滴后,直接喷入液氮中进行后续的玻璃化保存。此方法降温速率高达105℃/min，约为普通麦管降温速率的40倍，可有效实现玻璃化。Demirci等[5-8]曾提出利用声学驱动微机械喷射装置产生微滴，该装置产生的微滴尺寸极小，但细胞悬浮液浓度过大时，喷嘴极易堵塞。随后，Demirci等[9]又提出一种开放式无喷嘴喷射系统，然而该装置不利于悬浮液的稳定喷射。直到Samot等[10]提出一种多喷嘴共流微滴喷射玻璃化保存系统，喷射时氮气流与细胞悬浮液形成共流，氮气流将细胞悬浮液离散成微滴并直接喷射至聚乙烯薄片上，薄片用镊子夹取后放入液氮中进行玻璃化。

微滴玻璃化程度与液滴大小密切相关。Song等[11]通过实验证实，在超快速冷冻时，当微滴体积小于0.1 μL时，很容易实现玻璃化。Assal等[12]利用Samot等[10]提出的纳升级喷射微滴玻璃化保存系统应用于研究红细胞的玻璃化保存,并探究氮气流速、悬浮液注射速度、载体薄膜接收位置三个参数对微滴大小的影响。该研究将喷射、冻结、复温过程的损伤合在一起考虑，并不能看出喷射过程对细胞的损伤程度。除以上三个影响因素外，喷嘴针头型号和悬浮液浓度也可能对微滴大小和细胞玻璃化效果有较大影响，但未见相关报道。

本研究对氮气流速、悬浮液注射速度、悬浮液浓度、微滴接收位置和针头型号等喷射参数设计了单因素试验，研究喷射参数对微滴大小的影响；同时，通过统计微滴喷射后HepG2细胞的存活率，分析喷射参数对细胞活性的影响；最后，探究了不同喷射参数下微滴尺寸与细胞活性间的关系，以细胞活性作为评价标准，选择出最佳的喷射参数。

2 材料与方法

2.1 材料与设备

HepG2细胞,上海赛百慷生物技术股份有限公司；胎牛血清FBS,法国BIOSERA公司；DMEM细胞培养基,美国HYCLONE公司；胰酶,美国Sigma公司；D-hanks液,上海励瑞生物科技有限公司；台盼蓝染色液(2X),上海励瑞生物科技有限公司；二甲亚砜(Me2SO),德国APPLICHEM公司。

二氧化碳培养箱，MCO-18AC，松下医疗器械有限公司；液氮罐，YDS-50B-125，成都金凤有限公司；超低温冰箱，DW-8GL388A，青岛海尔特种电器有限公司；光学显微镜，CFI60，尼康。

2.2 微滴喷射装置介绍

微滴喷射装置见图1，主要由氮气流输送装置、细胞悬浮液注射装置、喷嘴三部分组成。工作原理为：氮气瓶提供氮气流，流量计调节氮气流速，通过氮气输出管将氮气输送至喷嘴敞口端；微注射泵推动微注射器，细胞悬液通过微注射器出口针头所连接的聚四氟乙烯管输送至插入喷嘴处的针管。喷嘴由200 μL 的移液器枪头和 25G/30G 尖口针头制作而成。

图1 微滴喷射装置示意图Fig.1 Schematic diagram of micro-droplet spray device

图2为喷嘴制作过程，首先将移液枪枪头顶端切除2 mm，再取下针头的不锈钢针管，最后将针管从距枪头尖端 2 cm 处侧面插入，直至针管露出枪头尖端 2 mm，将喷嘴固定于铁架台上。喷出的细胞用培养皿收集。

图2 喷嘴制作步骤(a).准备实验材料;(b).拔出针头;(c).枪头切去2 mm;(d).针头侧面插入Fig.2 Step of nozzle fabrication

2.3 微滴喷射单因素实验设计

将HepG2细胞悬浮于一定浓度的低温保护剂中进行微滴喷射实验，研究悬浮液浓度、氮气流速、悬浮液注射速度、接收位置及喷射针头型号等五个因素对微滴大小和细胞活性的影响。实验具体参数如下：氮气流速分别为2.4 、3.2、4.0 、4.8 L/min， 喷射针头为25G, 悬浮液浓度为10%Me2SO，悬浮液注射速度为200 μL/min，接收位置为距喷嘴6 cm处；悬浮液浓度分别为0.5%、10%Me2SO，喷射针头为25G，氮气流速为3.2 L/min，悬浮液注射速度200 μL/min，接收位置为距喷嘴6 cm处；悬浮液注射速度分别为160、180、200、220 μL/min，喷射针头为25G, 悬浮液浓度为10%Me2SO，氮气流速为3.2 L/min，接收位置为距喷嘴6 cm处；悬浮液接收位置分别为距喷嘴6、7.5、9 cm处，喷射针头为25G, 悬浮液浓度为10%Me2SO，氮气流速为3.2 L/min，悬浮液注射速度为200 μL/min；喷射针头型号分别为25G、30G，悬浮液浓度10%Me2SO，氮气流速为3.2 L/min，悬浮液注射速度为200 μL/min，接收位置为距喷嘴6 cm处。共五组单因素试验，每组设置三次平行实验，喷射的微滴用培养皿接收，每次接收时间为5 s，接收到的细胞进行显微拍照，以及细胞存活率和24 h贴壁率的测定。

2.4 显微拍照与图像处理

将接收到喷射微滴的培养皿迅速放至显微镜下拍照，获取放大40倍的微滴照片，每张照片选取三个视野。拍摄的照片用Image J处理软件对微滴分布情况进行统计。

2.5 细胞存活率及24 h贴壁率测定方法

吸取100 μL重悬的细胞到离心管内，加入100 μL台盼蓝染色液(2X)，混合均匀，染色3 min。再吸取10 μL经过染色后的细胞悬液，用血细胞计数板计数蓝色细胞数和细胞总数。按式(1)计算细胞存活率。

(1)

将细胞培养瓶放入CO2培养箱培养24 h后，用离心管收集上清液，并用2 mL的D-hanks清洗细胞两次，离心重悬后死细胞位于上清液及D-hanks清洗液中，活细胞都贴壁。贴壁细胞消化后，装入离心管中离心重悬。计数出活细胞及死细胞数量。同时观察细胞的生长情况和形态变化。按式(2)计算细胞24 h贴壁率。

(2)

2.6 统计学分析

采用统计分析软件 SPSS18.0 对微滴面积和细胞活性进行t检验，各处理组间相互比较，P<0.05 即认为差异具有统计学意义，P>0.05表示差异不具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 氮气流速对微滴喷射的影响

选用25G针头作喷嘴，10%Me2SO细胞悬液，悬浮液注射速度为200 μL/min，接收位置为距喷嘴6 cm处，氮气流速分别为2.4、3.2、4.0、4.8 L/min时，微滴喷射的液滴见图3。由图可以看出，随着氮气流速的增大，微滴尺寸明显减小，单个视野内微滴数明显增多，且微滴均匀性更好。说明氮气流速对微滴大小具有极其显著的影响，因此，可通过增加氮气流速来减小微滴体积。

表1为不同氮气流速下喷射的微滴大小及细胞活性的统计结果。从表中可以看出，氮气流速对微滴尺寸有显著影响，且对细胞活性具有显著影响。当其从2.4 L/min增加到3.2 L/min时，细胞存活率有所增加；继续增大氮气流速，当氮气流速从3.2 L/min继续增至4.8 L/min时，细胞活性却呈下降趋势。氮气流速为3.2 L/min时，细胞活性达到(90.17±2.10)%，而氮气流速为4.8 L/min喷射时，细胞存活率仅为(70.86±3.76)%。随着氮气流速增大，氮气流对细胞的剪切力也随之加大，容易对细胞造成机械性损伤。当设置氮气流速为3.2 L/min时，此时细胞活性最高，微滴直径也小于100 μm，可确定为适宜的氮气流速。

图3 氮气流速对微滴大小的影响(a).氮气流速2.4 L/min; (b).氮气流速3.2 L/min;(c).氮气流速4.0 L/min; (d).氮气流速4.8 L/minFig.3 Effect of nitrogen flow rate on droplet size表1 氮气流速对微滴喷射的影响Table 1 Effect of nitrogen flow rate on micro-droplet spray

氮气流速(L/min)微滴直径(μm)细胞存活率(%)2.4193.45±81.75a80.63±2.44bc3.299.77±19.92b90.17±2.10a4.073.83±17.06c81.40±2.43b4.829.65±8.73d70.86±3.76cd

注：同列标有不同小写字母表示组间差异具有统计学意义(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

3.2 悬浮液浓度对微滴喷射的影响

表2为不同悬浮液浓度时，微滴喷射的微滴大小及细胞活性。由表可知，当悬浮液浓度增加时，悬浮液尺寸明显减小，细胞活性略有增加，各组间并不存在显著性差异。原因是Me2SO存在一定的黏性，在一定范围内，增加悬浮液黏度，可减小产生的微滴尺寸。同时，细胞活性无显著性差异说明悬浮液中Me2SO浓度增加在喷射过程中并未对细胞产生明显渗透损伤。考虑到慢速冷冻HepG2细胞一般也采用10%Me2SO作为低温保护剂，故选用10%Me2SO作为低温保护剂加载细胞。

表2 悬浮液浓度对微滴喷射的影响Table 2 Effect of suspension concentration on micro-droplet spray

注：同列标有不同小写字母表示组间差异具有统计学意义(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

3.3 悬浮液注射速度对微滴喷射的影响

表3为不同悬浮液注射速度下，微滴喷射的微滴大小及细胞活性。从表中数据可以看出，当悬浮液注射速度由160 μL/min增至200 μL/min时，微滴体积随悬浮液注射速度增大而减小，当注射速度继续增至220 μL/min时，微滴尺寸有所增大，但各组间没有显著差异。但悬浮液注射速度对细胞活性却具有显著性影响，当悬浮液注射速度为200 μL/min时，此时细胞存活率明显高于其他组。可能是当细胞悬浮液和氮气流构成共流时，将悬浮液注射速度设置为200 μL/min，氮气流速设置为3.2 L/min，二者流速较匹配，此时产生的微滴尺寸较小，且对细胞造成的剪切力损伤最小，故最优的悬浮液注射速度可确定为200 μL/min。

表3 悬浮液注射速度对微滴喷射的影响Table 3 Effect of suspension injection rate on micro-droplet spray

注：同列标有不同小写字母表示组间差异具有统计学意义(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

3.4 微滴接收位置对微滴喷射的影响

表4为距喷嘴不同位置处接收的微滴大小及细胞活性。从表中数据可知，当接收距离从6 cm增至9 cm时，微滴直径随着接收距离的增大而减小，细胞存活率也减小。分析原因可能是随着接收距离增大，微滴越不容易出现重叠现象，因此微滴尺寸越小，同时，接收距离增大，微滴拥有的势能增大，转化的动能便增大，由此造成的薄片接触性损伤就越大，因此细胞活性会减小。当距离喷嘴6 cm处接收微滴时，此时得到的细胞活性最高，考虑到操作的方便性，接收位置不可过分接近喷嘴，故选择在距喷嘴6 cm处接收细胞。

表4 接收位置对微滴喷射的影响Table 4 Effect of receiving position on micro-droplet spray

注：同列标有不同小写字母表示组间差异具有统计学意义(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

3.5 针头型号对微滴喷射的影响

表5为选用不同型号针头喷射的微滴大小及细胞活性。结果显示，30G针头喷射的微滴尺寸明显较25G喷射的微滴尺寸小，且微滴的均匀性更良好。由表中数据可知，采用30G针头作喷嘴时，喷射出的微滴尺寸显著小于25G喷嘴，且细胞活性显著高于25G组。说明减小针头孔径到30G，并未对细胞造成更大的挤压、剪切损伤。

表5 针头型号对细胞活性的影响Table 5 Effect of needle type on cell activity

注：同列标有不同小写字母表示组间差异具有统计学意义(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

4 总结与展望

通过单因素实验研究悬浮液浓度、氮气流速、悬浮液注射速度、微滴接收位置以及喷射针头的型号等五个因素对微滴大小和细胞活性的影响。以细胞活性最高作为评估标准，确定最优的喷射参数为：选用30G针头作喷嘴，10%Me2SO细胞悬液，氮气流速为3.2 L/min，悬浮液注射速度为200 μL/min，接收位置为距离喷嘴6 cm处。采用此条件喷射的微滴半径明显小于100 μm，能够有效实现玻璃化。

本研究仅通过微滴喷射培养皿接收后的液滴大小和细胞存活率，对微滴喷射参数进行了优化，并未将细胞喷射入液氮完成完整地玻璃化保存过程，对于细胞微滴喷射玻璃化后的效果还需要进一步验证。仅以HepG2细胞为模型进行研究，该方法可以作为其他种类小体积细胞微滴喷射玻璃化保存的参考。另外，该微滴喷射系统如能解决大量收集的问题，即可实现小体积细胞高通量保存，满足临床应用的需求。