苦菜黄酮对高脂血症小鼠血脂代谢及保肝作用

单科开，王鸿飞*，许 凤*，罗 洁，李艳霞，韩爱茹，邵兴锋，韦莹莹

（宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315211）

高脂血症是当今一种很常见的慢性疾病，其发病原因是由于机体脂类代谢失调而导致血液中一种或几种脂质成分发生明显异常，相关的物质大量积累，从而引发脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压及心血管疾病等，极大地威胁着人们的生命健康[1-2]。当前，国内外降血脂的药物主要有他汀类、贝特类、烟酸类等，虽然药效显著，但受到已发现和潜在的副作用以及昂贵价格的影响，使用情况难尽人意[3]，理想的治疗高脂血症的药物仍然比较匮乏。近几年，对天然降血脂生物活性物质的研究越来越受到世界各国的重视，人们开始从天然产物中分离提取一些功能成分，如柑橘黄酮[4]、龙葵多酚[5]、大豆低聚糖[6]等，研究其调节血脂的作用，并取得了一定的成效。

苦菜（Sonchus oleraceus L.）是一种含有多种生物活性物质的药食同源植物，其活性物质包括黄酮类、氨基酸类、甾醇和苦素等[7]。其中黄酮类物质具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、保护心脑血管系统、抗病毒以及杀虫等广泛的生理活性[8]。研究发现，苦菜中黄酮类物质含量丰富[9]，但对苦菜黄酮（flavonoids from Sonchus oleraceus L.，FSOL）的降血脂和保肝功能报道不多。本实验研究苦菜黄酮对高血脂小鼠的降血脂和保肝作用，以期为苦菜黄酮的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性ICR小鼠，SPF级，体质量（20±2）g，由浙江省实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001，使用许可证号：SYXK（浙）2013-0191。

基础饲料由浙江省实验动物中心提供；高脂饲料由15%（质量分数，下同）猪油、3%胆固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、81.3%基础饲料组成。

干苦菜 安国药源商贸有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒 南京建成生物工程研究所；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

WK-200B高速药物粉碎机 山东青州市精诚机械有限公司；SB3200D超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Cary50Scan紫外分光光度计 美国瓦里安技术有限公司；H1850-R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；EGll50H包埋机、RM2245切片机 德国徕卡公司。

1.3 方法

1.3.1 FSOL的制备及测定

将购得的干苦菜经过粉碎机粉碎处理，过60 目筛，得到苦菜干粉。称取一定量的苦菜干粉，以料液比1∶60加入体积分数50%乙醇溶液，超声波提取，70 ℃水浴浸提160 min，进行离心（5 000 r/min、15 min）后将上清液进行抽滤，将滤液旋转蒸发后用大孔树脂AB-8进行分离纯化[10]，之后再经过旋转蒸发得到FSOL浓缩液。采用氯化铝法[11]测定FSOL的质量浓度，得到FSOL的质量浓度为62.2 mg/mL，取一定体积的FSOL溶液，用去离子水稀释至50 mg/mL，备用。

1.3.2 动物分组处理

取ICR小鼠60 只，随机分成6 组，每组10 只，即正常对照组、高脂模型组、阳性对照组、FSOL低剂量组、FSOL中剂量组、FSOL高剂量组。小鼠经过适应性喂养1 周后，正常对照组饲喂基础饲料，其他组均饲喂高脂饲料。每天分别给FSOL低、中、高剂量组小鼠灌胃50、100、200 mg/kg的FSOL，阳性对照组灌胃10 mg/kg的辛伐他汀，正常对照组和高脂模型组灌胃生理盐水，灌胃量都为10 mL/kg，连续饲养5 周，实验期间小鼠自由饮水和进食[12]。每周称量并记录各组小鼠体质量，便于调整灌胃剂量。末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，次日称体质量，眼眶取血，静置后在4 ℃条件下，以3 000 r/min离心10 min分离血清，将血清临时保存在-20 ℃冰箱中[13]。颈椎脱臼处死小鼠，解剖取出肝脏，用预冷生理盐水洗去表面血液，滤纸吸干，称质量，切取一部分用于制备病理切片，剩下部分用锡箔纸包裹后存放于-80 ℃冰箱中备用[14]。

1.3.3 指标测定

血清指标测定：取出血清，经过解冻后，按照试剂盒说明书的方法测定血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、MDA的浓度以及ALT、AST、SOD的活力，并按式（1）计算动脉粥样硬化指数（arteriosclerosis index，AI）。

肝脏指标测定：切取一定质量的肝脏，在冰浴条件下用生理盐水进行机械研磨，得到质量分数10%的肝组织匀浆，之后在4 ℃条件下，以2 500 r/min离心10 min，得到上清液[15]。按照试剂盒说明书的方法测定肝脏组织中TG、TC、MDA含量以及SOD活力。根据小鼠体质量和肝脏质量计算肝脏指数（（式）2）[16]。

式中：y为肝脏指数/%；m为肝脏质量/g；mb为小鼠体质量/g。

1.3.4 肝脏切片观察

参照Reza等[17]的方法。肝脏组织样品迅速浸泡在体积分数10%甲醛溶液中，脱水后嵌入石蜡内，切成5 μm厚的薄片，经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后进行病理组织观察。

1.4 数据统计与分析

数据以 ±s形式表示，采用SAS 8.1软件中Two Sample t-test for Means对组间数据进行分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 FSOL对小鼠体质量的影响

表1 FSOL对小鼠体质量的影响（x ±s，n＝10）Table 1 Effect of FSOL on body mass of mice (x s, n= 10)

表1 FSOL对小鼠体质量的影响（x ±s，n＝10）Table 1 Effect of FSOL on body mass of mice (x s, n= 10)

注：与正常对照组比较，*.差异显著（P＜0.05），**.差异极显著（P＜0.01）；与高脂模型组比较，#.差异显著（P＜0.05），##.差异极显著（P＜0.01），下同。

组别 体质量/g 增质量/g第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周正常对照组 20.21±2.14 22.09±2.01 23.81±2.18#25.40±2.66##26.84±3.01##28.36±2.85## 8.15±0.71##高脂模型组 20.96±2.1123.53±2.2326.35±2.30*29.51±2.18**32.05±2.98**35.00±3.60**14.04±1.49**阳性对照组 21.36±2.1323.47±2.02 25.34±2.12 27.12±2.52#28.68±2.69#30.58±3.11## 9.22±0.98*##FSOL低剂量组 20.64±1.6523.41±1.8526.27±2.06*28.88±2.82*31.54±3.05**33.93±3.04**13.29±1.39**FSOL中剂量组 21.62±2.5624.16±1.89*26.64±2.24*28.95±2.58**31.22±2.99**33.26±3.64**11.64±1.08**##FSOL高剂量组 20.81±1.9323.17±1.95 25.40±1.97 27.42±2.03#29.25±2.27#30.87±2.87#10.06±0.94**##

根据表1可知，经过5 周连续喂养，各组小鼠的体质量都有不同程度的增加。与正常对照组相比，高脂模型组体质量增加最多，说明饲喂高脂饲料能增加小鼠体质量。与高脂模型组相比，同是饲喂高脂饲料的条件下，阳性对照组和FSOL中、高剂量组体质量的增加量具有极显著差异（P＜0.01），FSOL低剂量组无显著差异（P＞0.05），说明FSOL剂量越高，小鼠体质量增加得越少，即FSOL对高脂血症小鼠体质量的增加有一定的控制效果。

2.2 FSOL对小鼠血脂水平的影响

表2 FSOL对小鼠血脂水平的影响（x ±s，n＝10）Table 2 Effect of FSOL on blood lipid levels of mice (x s, n= 10)

表2 FSOL对小鼠血脂水平的影响（x ±s，n＝10）Table 2 Effect of FSOL on blood lipid levels of mice (x s, n= 10)

组别 TC浓度/（mmol/L）TG浓度/（mmol/L）HDL-C浓度/（mmol/L）LDL-C浓度/（mmol/L） AI正常对照组 3.47±0.37## 0.57±0.05## 3.32±0.35## 0.53±0.06## 0.05±0.01##高脂模型组 5.46±0.64** 1.84±0.15** 2.77±0.22** 1.59±0.20** 0.97±0.12**阳性对照组 3.62±0.35## 0.66±0.05**## 3.11±0.31# 0.74±0.06**## 0.16±0.02**##FSOL低剂量组 4.53±0.51**## 1.14±0.09**## 2.92±0.35* 1.27±0.14**## 0.55±0.07**##FSOL中剂量组 4.20±0.37**## 1.06±0.08**## 3.04±0.36 0.96±0.10**## 0.38±0.04**##FSOL高剂量组 3.71±0.30## 0.79±0.06**## 3.16±0.34## 0.88±0.10**## 0.17±0.02**##

高水平TC、TG、LDL-C和低水平HDL-C是动脉粥样硬化的重要指标，医学上常用AI表示动脉粥样硬化的危险性[18]。由表2可知，饲喂5 周高脂饲料后，高脂模型组血清中TC、TG、LDL-C水平和AI极显著高于正常对照组（P＜0.01），HDL-C水平极显著低于正常对照组（P＜0.01）。与高脂模型组相比，阳性药物及低、中、高剂量的FSOL均能极显著降低高脂血症小鼠TC、TG、LDL-C的含量和AI（P＜0.01），不同的FSOL剂量组中，高剂量FSOL能极显著提高HDL-C含量（P＜0.01），但低、中剂量FSOL对此无显著影响（P＞0.05）。结果表明，在一定剂量范围内，高剂量的FSOL对小鼠实验性高脂血症和抗动脉粥样硬化有预防作用，能降低发生病症的风险。

2.3 FSOL对小鼠血清中ALT、AST活力的影响

表3 FSOL对小鼠血清中ALT、AST活力的影响（x ±s，n＝10）Table 3 Effect of FSOL on serum ALT and AST activities in mice ( s, n= 10)

表3 FSOL对小鼠血清中ALT、AST活力的影响（x ±s，n＝10）Table 3 Effect of FSOL on serum ALT and AST activities in mice ( s, n= 10)

组别 ALT活力/（U/L） AST活力/（U/L）正常对照组 13.57±1.44## 11.03±1.41##高脂模型组 32.65±3.86** 19.23±2.34**阳性对照组 18.65±1.66**## 16.13±1.71**##FSOL低剂量组 28.76±3.00**# 17.82±1.66**FSOL中剂量组 24.64±1.99**## 14.83±1.57**##FSOL高剂量组 23.83±2.12**## 12.96±1.27**##

ALT、AST的活力能反映肝脏的受损情况，血清中较高的ALT和AST水平说明肝脏有一定程度的损伤。根据表3可知，高脂模型组血清中ALT、AST活力极显著高于正常对照组（P＜0.01）。与高脂模型组相比，阳性药物及中、高剂量的FSOL能极显著降低ALT、AST活力（P＜0.01），低剂量的FSOL能显著降低ALT活力（P＜0.05），但对AST活力无显著影响（P＞0.05）。结果表明，FSOL对小鼠肝脏具有一定的保护作用。

2.4 FSOL对小鼠血清和肝脏MDA和SOD水平的影响

表4 FSOL对小鼠血清和肝脏MDA和SOD水平的影响（x ±s，n＝10）Table 4 Effect of FSOL on MDA concentration and SOD activity in serum and liver of mice (x s, n= 10)

表4 FSOL对小鼠血清和肝脏MDA和SOD水平的影响（x ±s，n＝10）Table 4 Effect of FSOL on MDA concentration and SOD activity in serum and liver of mice (x s, n= 10)

血清 肝脏MDA浓度/（nmol/mL）SOD含量/（U/mg）正常对照组 7.31±0.68## 170.58±13.79 1.31±0.14## 279.40±30.06##高脂模型组 10.26±1.10** 158.35±17.04 4.15±0.51** 181.44±22.06**阳性对照组 7.86±0.82## 183.47±21.34## 1.89±0.20**##231.26±25.82**##FSOL低剂量组 9.24±0.99**# 171.33±17.06 3.63±0.32**#216.53±20.13**##FSOL中剂量组 8.78±0.79**## 180.56±20.16# 2.86±0.27**##228.88±22.35**##FSOL高剂量组 8.45±0.79**##192.15±17.87**## 2.16±0.23**## 259.85±27.50##组别SOD活力/（U/mL）MDA含量/（nmol/mg）

血清和肝脏中MDA水平和SOD活力可以反映出机体的抗氧化能力和肝脏的损伤情况，高水平的MDA和低水平的SOD表明机体脂质过氧化严重以及肝脏有一定程度损伤。根据表4可知，高脂模型组血清和肝脏中MDA浓度极显著高于正常对照组（P＜0.01），肝脏中SOD活力极显著低于正常对照组（P＜0.01）。与高脂模型组相比，阳性药物及高剂量的FSOL能极显著降低血清和肝脏中MDA水平，提高血清和肝脏中SOD活力（P＜0.01）；低剂量的FSOL能显著降低血清和肝脏中MDA水平（P＜0.05），极显著提高肝脏中SOD活力（P＜0.01），但对血清中SOD活力无显著影响（P＞0.05）；中剂量的FSOL能极显著降低血清和肝脏中MDA含量，提高肝脏中SOD活力（P＜0.01），显著提高血清中SOD活力（P＜0.05）。说明一定剂量的FSOL能降低高脂血症小鼠机体的过氧化，对肝脏的损伤有一定的保护作用。

2.5 FSOL对小鼠肝脏中TC、TG含量及肝脏指数的影响

表5 FSOL对小鼠肝脏中TC、TG含量及肝脏指数的影响（x ±s，n＝10）Table 5 Effect of FSOL on liver TC and TG levels and liver index of mice (x s, n= 10)

表5 FSOL对小鼠肝脏中TC、TG含量及肝脏指数的影响（x ±s，n＝10）Table 5 Effect of FSOL on liver TC and TG levels and liver index of mice (x s, n= 10)

组别 TC含量/（mmol/g）TG含量/（mmol/g） 肝脏指数/%正常对照组 0.21±0.02## 0.74±0.08## 3.68±0.34##高脂模型组 0.49±0.05** 0.96±0.09** 4.77±0.51**阳性对照组 0.27±0.03**## 0.81±0.08## 3.81±0.34##FSOL低剂量组 0.42±0.03**## 0.91±0.08** 4.53±0.49**FSOL中剂量组 0.37±0.03**## 0.87±0.09**# 4.12±0.38*##FSOL高剂量组 0.34±0.03**## 0.83±0.09*## 3.96±0.37##

由表5可知，高脂模型组肝脏中TC、TG含量和肝脏指数极显著高于正常对照组（P＜0.01）。与高脂模型组相比，阳性药物及高剂量的FSOL能极显著降低肝脏中TC、TG含量和肝脏指数（P＜0.01）；低剂量的FSOL能极显著降低肝脏中TC含量（P＜0.01），但对肝脏中TG含量和肝脏指数无显著影响（P＞0.05）；中剂量的FSOL能极显著降低肝脏中TC含量和肝脏指数（P＜0.01），显著降低肝脏中TG含量（P＜0.05）。结果表明，FSOL能降低高脂血症小鼠肝脏中TC、TG含量，并且降低肝脏指数，对肝脏有一定的保护作用。

2.6 FSOL对小鼠肝脏组织病理变化的影响

图1 小鼠肝组织HE染色（400×）Fig. 1 Hematoxylin-eosin staining of liver tissues from mice (400 ×)

如图1所示，正常对照组小鼠肝组织中肝小叶结构清晰完整，肝细胞排列紧密且形态正常，胞浆内未出现脂肪空泡、脂肪变性和脂肪坏死等现象。高脂模型组中肝小叶结构不清晰，肝细胞体积变大且部分坏死，中央静脉附近的肝细胞排列紊乱，形态不完整，胞质内充满大量脂肪空泡，呈现非酒精性脂肪性肝病的组织病理学现象[19]。与高脂模型组相比，阳性对照组及FSOL低、中、高剂量组对肝细胞的脂肪变性出现不同程度的改善，胞浆内的脂肪空泡都有减少，肝细胞排列整齐，其中FSOL高剂量组改善效果最明显，肝小叶结构完整，部分切片与正常对照组相似。

3 讨 论

本研究通过饲喂高脂饲料建立高脂血症小鼠模型，根据分组灌胃阳性药物及不同剂量的FSOL，5 周后测定小鼠理化指标，并且观察小鼠肝组织切片确定肝脏受损情况。通过正常对照组和高脂模型组比较，发现在小鼠血清及肝脏中TC、TG等多个指标水平具有极显著差异，说明高脂血症小鼠模型建立成功，进一步通过对高脂血症小鼠灌胃不同剂量的FSOL，研究FSOL对高脂血症小鼠降血脂的能力。

TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平是检验高脂血症的重要指标[20]，其中血清中TC水平的升高是动脉粥样硬化的危险因素之一[21]。LDL-C的功能是将胆固醇运输到组织中，充当输送的载体，但在运输过程中容易导致胆固醇积累在动脉管壁上，造成动脉粥样硬化，是动脉粥样硬化的重要致病因素，其含量与动脉粥样硬化呈明显的正相关，而HDL-C是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，它能够将组织或者动脉壁上的胆固醇分离下来，然后运输到肝脏中将胆固醇分解，最后通过胆汁排出。另外，单一的高TG血症虽然不是引发心血管疾病的独立危险因素，但是同时出现血清中TC水平升高或者HDL-C水平降低的情况时，高水平的TG是引发心血管疾病的因素之一[22]。医学研究表明，血清中TC、TG、LDL-C水平的升高和HDL-C水平的降低更容易诱发动脉粥样硬化和心脑血管疾病[23]。通过对实验数据分析得出，高剂量的FSOL能显著降低血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，同时也降低肝脏组织中TC、TG水平，与高脂模型组相比，FSOL高剂量组中HDL-C水平比阳性对照组高，说明FSOL的作用可能是通过提高HDL-C的含量，从而使TC、TG、LDL-C的含量降低，达到降低血脂的目的。

肝脏通过调节碳水化合物、脂肪和蛋白质的合成及分解，维持着一个较为稳定的内环境[24]。肝脏损伤与其代谢异常密切相关，其中脂质代谢紊乱是肝脏损伤的一个重要因素。肝脏指数能反映肝脏的损伤程度[25]，此外，在医学上检测肝组织中ALT、AST是反映肝功能的主要指标。研究表明，在肝脏组织中，ALT主要分布于肝细胞浆的可溶性部分，AST主要分布于肝细胞浆的可溶性部分及线粒体中。当肝细胞受到损伤时，胞内的大部分ALT、AST被释放到血液中，造成血液中ALT、AST水平升高[26]，通过测定高脂血症小鼠血清中ALT、AST水平分析FSOL对高脂血症小鼠的肝脏是否有保护作用。根据数据分析得出，与高脂模型组比较，阳性药物及中、高剂量的FSOL能极显著降低ALT、AST水平（P＜0.01），低剂量的FSOL能显著降低ALT水平（P＜0.05），但对AST水平无显著影响（P＞0.05），可能的原因是低剂量的FSOL对高脂血症小鼠肝脏的保护作用较小，使血清中AST水平降低不明显。与正常对照组比较，阳性对照组ALT、AST水平存在极显著差异（P＜0.01），可能原因是阳性药物浓度较高，导致肝脏代谢压力增大，使肝脏造成一定程度损伤[27]。通过肝脏组织切片观察，FSOL低、中、高剂量表现出剂量-效应关系，FSOL高剂量作用效果最明显，中剂量次之，低剂量存在一定程度的脂肪变性，说明在一定范围内，高剂量的FSOL对肝脏具有保护作用。

在食用高脂食物过程中会造成机体血脂异常，血脂异常会导致机体抗氧化能力下降，氧自由基生成量增加，脂质过氧化作用增强[28]。SOD是机体细胞主要的抗氧化酶之一，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断自由基的毒性作用，是维持生物体自由基产生和过氧化物清除能力平衡的重要物质[29]，检测机体中SOD水平可以反映机体组织的抗氧化能力。MDA是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分子产物，对细胞膜有严重的破坏作用，机体中MDA的水平可以间接反映机体组织细胞的过氧化程度[30]。通过数据分析得到，高脂模型组肝脏中MDA含量明显高于正常对照组，SOD活力极显著低于正常对照组（P＜0.01），表明高脂血症小鼠体内发生了明显的脂质过氧化反应，肝脏的抗氧化能力降低[31]。与高脂模型组比较，高剂量的FSOL能极显著降低MDA含量及提高SOD活力（P＜0.01），表明FSOL能降低高脂血症小鼠脂质过氧化和提高机体抗氧化能力，减弱自由基在高脂血症的发生和发展过程中所起的作用，发挥防治动脉硬化等心血管疾病的能力。

综上所述，FSOL能降低因高脂血症引发的小鼠的血脂水平升高，同时还能改善小鼠的肝脏损伤，降低高脂血症小鼠体内脂质过氧化产物的含量，提高机体的抗氧化能力，这对于预防高脂血症的发生有重要的作用，另外也为FSOL的开发提供了理论依据。