巴马特色饮食模式对D-半乳糖致衰老小鼠运动能力和抗焦虑水平的影响

兰海静，杨伯宁，黄联莉，孙 荟，宋 奇，黄燕婷，何潜祖，李 萌，李全阳,*

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.广西医科大学基础医学院，广西 南宁 530021；3.广西普生三凤乳业有限公司，广西 南宁 530226；4.广西大学医院，广西 南宁 530004）

《“健康中国2030”规划纲要》[1]把人们对健康食品的重视程度提升到一个新高度，为此我们试图采用“问计于百岁老人求健康饮食”的策略，探索新型的健康饮食模式。日常饮食习惯在健康衰老中被认为是最重要的影响因素[2-3]，对大脑认知功能也有很大的影响[4-5]。地中海饮食被认为是一种被广泛认可的健康饮食模式，对多种疾病具有预防、治疗作用[6]，如心血管疾病和其他与年龄相关的疾病[2,7]；也可降低总死亡率及癌症风险[8]，并改善认知功能[4,9]。其饮食营养成分特点是高纤维素、高蛋白质、低脂肪和低热量[8]。除此之外，冲绳的长寿优势被认为与健康的生活方式有关，冲绳传统饮食中主食为红薯，这可能有助于减少与年龄相关的慢性疾病，如癌症和心血管疾病[2,10]。

本团队的前期研究已对巴马长寿地区老人的营养素摄入量和饮食结构进行了调查分析，“世界长寿之乡”巴马长寿人群日常膳食中碳水化合物比例、维生素摄入量偏高，且具有低能量、低脂肪、低蛋白、低胆固醇的特征，有利于人类健康长寿[11]。王芳的研究表明广西巴马长寿地区是以粥类、粗杂粮类等食物为主的膳食纤维多糖饮食模式[12]。宋奇等[13]研究的5 种巴马长寿饮食模式中复合饮食对衰老小鼠的抗氧化应激效果最佳，而元素组的抗氧化应激效果并不明显，表明巴马长寿饮食模式具有较显著的抗衰老作用和良好的开发潜力。单一食材不足以评估饮食对健康长寿的影响，组合型食物能够更大限度地发挥膳食抗氧化剂的作用[14]。

在现有文献中，多数研究都以预防与年龄有关的慢性疾病为出发点，鲜有从借鉴长寿地区饮食结构的角度切入，构建健康长寿饮食模式再进行研究验证的报道[7]；而且因各地的食材和气候差别很大，国外的饮食模式很难被中国普通人群所接受，从而有必要探索适合中国普通居民健康长寿的新型饮食模式。目前鲜有饮食模式对衰老小鼠的运动能力和抗焦虑水平影响效果的报道，以及改善衰老动物运动协调能力及抗焦虑能力对饮食模式效果的研究。为此，本研究总结巴马长寿老人的饮食特点及特色益生菌，构建巴马特色饮食模式，利用动物模型进行验证，进一步从D-半乳糖致衰老小鼠运动能力和抗焦虑方面来探索巴马特色饮食模式对衰老小鼠的抗衰老效果，以期为适合中国普通居民健康长寿新型饮食模式的构建提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

6 周龄SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体质量（25±2）g，购自广西医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK（桂）2014-002），饲养温度控制在（24±2）℃，相对湿度（60±10）%，12 h昼夜交替，每天给予5 g饲料[15-16]，自由饮水。

白藜芦醇、抗坏血酸钠、大豆异黄酮、低聚木糖、D-半乳糖 上海源叶生物技术有限公司；基础饲料（符合GB 13078—2017《饲料卫生标准》和GB 14924.3—2010《实验动物 配合饲料营养成分》要求） 北京科奥协力饲料有限公司；低聚果糖 量子高科（中国）生物股份有限公司；异麦芽低聚糖 山东天久生物技术有限公司；VE粉末、VA醋酸酯干粉末 新昌新和成维生素有限公司；LT-P132发酵乳杆菌、LT-L614干酪乳杆菌（均分离自广西巴马百岁老人粪便） 广西大学轻工与食品工程学院实验室；MRS培养基按GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》方法配制，固态培养基中添加质量分数1.5%琼脂。

1.2 仪器与设备

超微粉碎机 浙江省温岭市创力药材机械厂；旷场测试系统 西班牙Panlab公司；立式高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械有限公司；超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；KQ320DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；WGL-125B电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠饲料的制备

因巴马特色饮食模式以膳食纤维多糖为主，具有高膳食纤维、高VA、低能量、低脂肪、低蛋白、低胆固醇摄入的特征，同时微量元素铁、锰、钴、硒对健康长寿现象的形成具有重要而积极的影响[11-12]。宋奇等的研究结果表明5 种巴马长寿饮食模式中复合饮食对衰老小鼠的抗氧化应激效果最佳[13]。因此，本研究将小鼠基础饲料打粉，以此为基础设计巴马特色饲料。依据宋奇等[13]的研究结果，结合GB 14924.3—2010、中国居民膳食营养素推荐摄入量、保健食品检验与评价技术规范（2003年版）、文献[11]中巴马百岁组营养素摄入量，并参考齐广海[17]、侯放亮[18]等的方法，配制巴马特色饲料II、III、IV，并以巴马特色益生菌发酵乳杆菌LT-P132和干酪乳杆菌LT-L614体积比1∶1混合灌胃，加以基础饲料喂食作为巴马特色饮食模式I（模式I）。巴马特色饮食模式II（模式II）饲料中VA、VE及微量元素铁、锰、硒的添加量依据GB 14924.3—2010设计；硒、钴添加量参考宋奇等[13]实验中元素组、复合组设计；大豆异黄酮、VC及白藜芦醇添加量参考文献[19-21]设计；膳食纤维添加量参考文献[22-24]设计。巴马特色饮食模式III（模式III）饲料中维生素类及微量元素添加量依据中国居民膳食营养素推荐摄入量10 倍和保健食品检验与评价技术规范（2003年版）设计；大豆异黄酮及白藜芦醇添加量参考文献[19,25]设计；膳食纤维添加量参考文献[26-28]设计。巴马特色饮食模式IV（模式IV）饲料中膳食纤维添加量参考文献[28-30]设计，维生素类及微量元素类添加量参考巴马百岁老人摄入量[31]，白藜芦醇及大豆异黄酮添加量参考文献[19,32]设计。

1.3.2 动物分组及处理

SPF级昆明小鼠适应性喂养1 周后，每组10 只，雌雄各半，随机分成6 组：年轻对照组、衰老模型组、巴马特色饮食模式I、II、III、IV组。除年轻对照组注射等体积生理盐水外，其余5 组每日上午颈背部皮下注射100 g/L D-半乳糖溶液0.2 mL/20 g mb建立衰老模型。从造模第9周开始，除年轻对照组外，其他组均继续注射D-半乳糖溶液。巴马特色饮食模式II、III、IV组每天给予相应巴马特色饲料饲养，巴马特色饮食模式I组给予基础饲料饲养，各巴马特色饮食组均按0.1 mL/10 g mb分别灌胃浓度为109CFU/mL的干酪乳杆菌LT-L614、发酵乳杆菌LT-P132（体积比1∶1），其余组继续以基础饲料饲喂，灌胃等量生理盐水。于实验第18周开展运动能力和抗焦虑测试，整个饲养过程中无小鼠死亡，每周称体质量一次。

1.3.3 行为学实验

旷场实验参照文献[33-36]进行。紧绳实验参照文献[37-39]进行。

1.4 数据统计与分析

实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有结果表示为 ±s。如果数据呈正态分布，则进行组间多重比较，采用单因素方差分析和Duncan’s检验；如果数据呈非正态分布，则进行组间Kruskal-Wallis检验。显著性水平定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 巴马特色饮食模式对D-半乳糖致衰老小鼠体质量的影响

图1 巴马特色饮食模式对D-半乳糖致衰老小鼠体质量的影响Fig. 1 Effect of Bama characteristic dietary patterns on body mass of D-galactose-induced aging mice

体质量的改变是衰老的生理指标之一[40]。本研究持续追踪了整个实验期间小鼠的体质量变化，由图1可知，各组小鼠的初始体质量没有明显差异，与年轻对照组相比，衰老模型组小鼠体质量增加缓慢，可能是由于随着D-半乳糖处理时间的延长，小鼠衰老程度不断加重而造成的。在第9周，饲喂巴马特色饲料及灌胃益生菌后，各组小鼠体质量在整个饲养过程中没有显著性差异（P＞0.05），整体的变化趋势为：在第10周时各组小鼠体质量有下降趋势；在第11周时各小组小鼠体质量开始缓慢增加，直至第16周时达最高点。Spindler等[41]的研究中未观察到营养品组合对小鼠体质量增长具有显著性差异。本研究中巴马特色饮食模式也均未对D-半乳糖致衰老小鼠体质量产生影响，表明巴马特色饮食模式对D-半乳糖致衰老小鼠的生长发育基本没有影响。

2.2 巴马特色饮食模式对D-半乳糖致衰老小鼠旷场实验的影响

图2 巴马特色饮食模式对旷场实验中各组小鼠后肢直立数（A）、穿越方格数（B）、总运动距离（C）及平均速率（D）的影响Fig. 2 Effect of Bama characteristic dietary patterns on the number of hind limb stand (A), the number of squares crossed (B), total movement distance (C) and average speed (D) of each group

旷场实验是评估小鼠对新环境的自发探索行为和感觉运动能力时使用比较广泛的一种行为学实验[35,42]，跨越方格数和后肢直立数可以表征小鼠的活动能力[36]。D-半乳糖可以损伤小鼠自发探索能力[43-44]，且经过D-半乳糖处理的小鼠在一系列行为测试中显示出与衰老有关的缺陷[43]。由图2A可知，与年轻对照组相比，衰老模型组小鼠后肢直立数显著减少至（9.40±4.43）次（P＜0.05），表明经D-半乳糖处理的小鼠运动探究能力显著衰退。模式I、II、III、IV组小鼠的后肢直立数与年轻对照组无显著性差异（P＞0.05）；与衰老模型组比，模式I、II、III、IV组小鼠后肢直立数分别提高至（18.20±7.38）、（21.80±8.95）、（19.70±11.28）、（18.30±8.92）次，表明巴马特色饮食模式能缓解或修复D-半乳糖致衰老因子所造成的小鼠活动能力损伤，提高衰老小鼠的自主活动能力及适应能力，降低其焦虑水平。与模式I组相比，模式II组小鼠后肢直立数提高幅度最大，提高了19.78%，表明巴马特色饮食模式II较模式I对改善致衰老小鼠运动探究能力的作用效果更佳。由图2B、C可知，与年轻对照组相比，衰老模型组小鼠穿越方格数、总运动距离分别下降了14.10%和13.62%（P＞0.05），显示D-半乳糖能使小鼠在一定程度上产生运动障碍。模式II组较衰老模型组、模式I组小鼠穿越方格数分别增加19.71%、13.89%（P＞0.05），总运动距离分别提高16.92%、9.76%（P＞0.05）。从图2D可以看出，模式II组小鼠的平均速率大于衰老模型组及模式I组小鼠。表明巴马特色饮食模式II相对于模式I而言对D-半乳糖致衰老小鼠运动探究能力具有更好的改善作用，增加了D-半乳糖致衰老小鼠对新环境的探索动力。

为了更具体地展现小鼠在旷场中的运动情况，采用小鼠累积活动量三维图来表征小鼠在旷场中的运动情况（图3）。

图3 各组小鼠旷场实验典型运动情况Fig. 3 Typical movement maps of mice from each group in open field test

由图3可知，年轻对照组小鼠在旷场中活动范围广泛，多趋向于在旷场中心活动。衰老模型组小鼠几乎不到旷场中心活动，活动范围较窄，且多趋向于旷场周边。模式I组小鼠多于旷场周边运动，其运动量大于衰老模型组。模式II、III、IV组小鼠活动范围较广，运动量增加，其中模式II、III组小鼠较年轻对照组、衰老模型组和模式I组小鼠表现更佳。

旷场实验还可以用来评估小鼠情绪反应[33]及焦虑性[34]。小鼠在旷场中央区域活动时间越短，表明其焦虑水平越高；后肢直立次数越多，表明其焦虑性越低[45]。衰老可显著影响小鼠情绪[46]。从图4A中可以看出，年轻对照组小鼠在旷场中总运动时间为（277.34±11.34）s。与年轻对照组相比，衰老模型组小鼠总运动时间显著缩短至（260.21±17.65）s，表明D-半乳糖损害了衰老小鼠的运动探究能力。巴马特色饮食模式I、II、III、IV组小鼠的总运动时间分别为（273.11±9.53）、（273.72±8.78）、（274.10±12.68）、（272.47±17.97）s，与年轻对照组相比没有显著性差异（P＞0.05），表明巴马特色饮食模式均能使D-半乳糖致衰老小鼠的运动能力提高至正常水平。与衰老模型组相比，巴马特色饮食模式I、II、III、IV组小鼠的总运动时间分别显著延长了4.96%、5.19%、5.34%和4.71%（P＜0.05），表明巴马特色饮食能改善由D-半乳糖所致的运动损伤。

图4 各组小鼠总运动时间（A）及在旷场中央区域活动时间（B）Fig. 4 Effect of Bama characteristic dietary patterns on total movement time (A) and central activity time (B) of each group in open field test

由图4B可知，年轻对照组小鼠旷场中央区域活动时间为（46.45±14.04）s。与年轻对照组小鼠相比，衰老模型组小鼠旷场中央区域活动时间显著缩短了33.33%（P＜0.05）；模式I、II、IV组小鼠旷场中央区域活动时间较年轻对照组均无显著性差异（P＞0.05），分别为（50.52±14.42）、（53.72±11.05）s及（49.08±8.38）s，表明模式I、II、IV均能对D-半乳糖致衰老小鼠的情绪有调节作用。与衰老模型组相比，模式I、II、III、IV组小鼠中央区域活动时间分别显著延长了63.12%、73.46%、116.60%和58.48%（P＜0.05），表明巴马特色饮食模式能降低D-半乳糖致衰老小鼠的焦虑水平，使其对新刺激的敏感性增加。与模式I组相比，模式III组小鼠中央区域活动时间显著延长32.78%，表明巴马特色饮食模式III对D-半乳糖致衰老小鼠焦虑性的抑制效果明显优于模式I。与年轻对照组相比，模式III组小鼠旷场中央区域活动时间显著延长了44.41%（P＜0.05），这种现象在目前研究中还鲜有报道，进一步表明巴马特色饮食模式III能逆转D-半乳糖致衰老小鼠的焦虑性，使其情绪更加稳定。

据报道，灌胃100 mg/kg紫甘薯色素能使注射质量分数5% D-半乳糖8 周致衰老小鼠跨越方格数提高至130 格[43]；灌胃高、中剂量的活性肽-N分别能使注射质量分数1% D-半乳糖致衰老小鼠后肢直立数提高83.85%（P＜0.05）、119.10%（P＜0.01）[47]。本研究通过注射18 周质量分数10% D-半乳糖使小鼠衰老，巴马特色饮食模式II、III、IV组小鼠的后肢直立数分别提高131.91%（P＜0.05）、109.57%（P＜0.05）和94.68%（P＞0.05），表明巴马特色饮食能明显提高致衰老小鼠的活动能力。Tian Yan等[35]研究发现，灌胃400 mg/（kg·d）高分子质量柿子单宁能使D-半乳糖致衰老小鼠后肢直立数和跨越方格数分别增加至8 次和110 格，而本实验中巴马特色饮食模式II、III、IV组小鼠平均后肢直立数几乎是其2 倍。模式II使D-半乳糖致衰老小鼠的运动距离增加16.92%（P＞0.05），旷场中央区域活动时间显著延长73.46%（P＜0.05）；模式III使致衰老小鼠中央区域活动时间显著延长116.60%（P＜0.05）。Zhang Yan等[48]研究发现，饲喂柚皮素后，注射150 mg/kg D-半乳糖8 周致衰老小鼠的运动距离显著提高约11.54%，旷场中央区域活动时间显著延长约57.14%。对比看来，本研究中的模式II、III对致衰老小鼠的抗焦虑性、自发探索行为及感觉运动能力的提高效果与相关报道结果相比具有一定的优势。

2.3 巴马特色饮食模式对D-半乳糖致衰老小鼠紧绳实验的影响

紧绳实验主要检测小鼠神经肌肉协调与感觉运动能力[49]，它要求小鼠有较好的协调能力、较强的肌肉力量和较低的焦虑水平[37]。悬挂时间考察小鼠体力及平衡能力，悬挂时间的缩短及转换分值的下降反映小鼠运动平衡能力的下降[37]。由图5A可知，衰老模型组小鼠悬挂时间较年轻对照组缩短24.88%（P＞0.05），表明D-半乳糖致衰老小鼠的平衡运动能力减退。模式II、III、IV组小鼠悬挂时间相对于年轻对照组分别延长至（58.90±4.74）、（57.67±6.28）、（57.47±7.78）s（P＞0.05），表明巴马特色饮食模式II、III、IV能提高致衰老小鼠的运动协调能力。与衰老模型组相比，巴马特色饮食模式I～IV组小鼠悬挂时间分别延长20.45%（P＞0.05）、51.92%（P＜0.05）、48.75%（P＜0.05）和48.23%（P＜0.05）。与模式I组相比，模式II、III、IV组小鼠悬挂时间分别显著延长26.12%、23.49%及23.06%（P＜0.05），表明巴马特色饮食能显著改善衰老小鼠肌肉力量、运动协调性和平衡能力，且效果优于益生菌饮食。

图5 各组小鼠紧绳悬挂时间（A）、转换分值（B）Fig. 5 Effect of Bama characteristic dietary patterns on suspension time (A) and conversion score (B) of each group in tight rope test

由图5B可知，与年轻对照组相比，衰老模型组小鼠转换分值显著减少43.55%（P＜0.05），模式I组小鼠转换分值下降15.43%（P＞0.05），而模式II、III、IV组分别提高43.66%（P＜0.05）、39.33%（P＜0.05）和16.02%（P＞0.05），表明巴马特色饮食模式II、III能显著逆转D-半乳糖致衰老小鼠的运动失衡，提高其感觉运动能力，且效果明显优于模式I。与衰老模型组小鼠相比，巴马特色饮食模式I～IV组小鼠转换分值分别显著增加了49.81%、154.47%、146.79%和105.50%（P＜0.05）。表明巴马特色饮食模式能显著改善D-半乳糖致衰老小鼠肌肉力量、运动协调性和感觉运动能力，其中模式II、III效果更佳。

白藜芦醇能显著提高衰老小鼠神经肌肉协调与感觉运动能力，使得衰老小鼠的悬挂时间显著延长42.86%，转换分值显著增加75%[49]。本研究中巴马特色饮食模式II组小鼠能将悬挂时间显著延长51.92%（P＜0.05），转换分值显著增加154.47%（P＜0.05），与相关报道相比具有一定的优势。然而，在现有文献中鲜有对饮食模式改善神经肌肉协调与感觉运动能力方面的研究。本研究发现D-半乳糖致衰老小鼠经巴马特色饮食模式干预后，模式II、III、IV组小鼠悬挂时间及转换分值均得到显著延长和提高，此现象在目前饮食模式的相关研究中鲜有报道。

3 结 论

本研究以“问计于百岁老人求健康饮食”为出发点，以巴马长寿老人饮食特征为借鉴，探索新型健康的饮食模式，设计了4 种巴马特色饮食模式，并利用D-半乳糖致衰老小鼠模型进行验证。研究发现，各巴马特色饮食模式均对D-半乳糖致衰老小鼠的体质量变化没有显著影响（P＞0.05）。通过旷场实验、紧绳实验来探究巴马特色饮食模式对衰老小鼠模型自发探索行为、神经肌肉协调性、感觉运动能力和抗焦虑水平的影响，发现在旷场实验中巴马饮食模式能提高衰老小鼠的后肢直立数和跨越方格数，增加衰老小鼠的运动距离和平均移动速率，显著延长D-半乳糖致衰老小鼠的总运动时间及在旷场中央区域活动时间（P＜0.05），其中模式III组小鼠在旷场中心活动时间较年轻对照组显著延长（P＜0.05），表明巴马特色饮食模式III对改善D-半乳糖致衰老小鼠自发运动能力和抗焦虑水平的效果好于模式I、IV。紧绳实验结果表明，巴马特色饮食模式能够显著延长衰老小鼠悬挂时间（P＜0.05），显著提高转换分值（P＜0.05），巴马特色饮食模式II、III、IV组小鼠悬挂时间均长于年轻对照组（P＞0.05），模式II、III组小鼠转换分值较年轻对照组分别显著提高43.66%和39.33%（P＜0.05），表明巴马特色饮食对保护衰老小鼠的神经肌肉协调性和感觉运动能力具有良好的效果，这种现象在目前研究中还鲜见报道。综上所述，巴马特色饮食模式能改善D-半乳糖致衰老小鼠的运动能力和抗焦虑水平，且巴马特色饮食模式II、III、IV的效果要优于模式I，尤其是巴马特色饮食模式II、III值得深入探讨，以期能够服务于普通人群。