母乳与山羊乳功能性不饱和脂肪酸及脂肪球微观结构的比较

张 宇，王立娜，张宏达，李晓东,*，刘 璐，冷友斌，巩燕妮，蒋士龙

（1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江飞鹤乳业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江完达山林海液奶有限公司，黑龙江 牡丹江 157100）

母乳为婴儿提供所需的膳食能量、必需营养素以及生理活性分子。母乳的脂质占母乳总能量的40%～55%，为新生儿提供了大约一半的能量需求；同时，其也提供了基本的脂肪酸（fatty acid，FA）和脂溶性维生素。功能性FA是特指那些来源于人类膳食油脂、满足人体营养需求，并对人体一些相应缺乏症和内源性疾病有积极防治作用的FA，如花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、亚油酸（linoleic acid，LA）等。功能性FA的组成与含量取决于乳的品种、泌乳阶段等[1]。郭紫玥[2]综合研究了母乳与牛乳、羊乳中3 种主要功能性FA（ARA、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA））的变化规律，发现与牛乳相比，羊乳中这3 种FA水平与母乳更为接近。山羊乳含有人体所需要的多种营养素及生物活性物质[3]，且脂肪结构与母乳较为接近，营养价值高。解庆刚等[4]研究发现山羊乳有牛乳和绵羊乳不可比拟的优势，其脂肪更容易被消化；山羊乳中不易消化的棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）含量比牛乳低，而易消化的中短链FA比牛乳和绵羊乳高。

乳中脂肪以微小的球状液滴或乳脂肪球（milk fat globule，MFG）的形式分布，以乳液形式稳定存在。Keenan[5]、Mather[6]以及Heid[7]等对优质母乳MFG的来源和分泌进行了详细的介绍，认为MFG在乳腺的分泌细胞中形成。甘油三酯（triacylglycerols，TAG）在粗面内质网表面上或表面内合成，并在细胞质中以微脂滴的形式积累；MFG的粒径、分布与多种因素有关，即使同一种乳的MFG，其粒径也会有很大差异，与乳的性质和加工特性密切相关[8]。

目前，对不同泌乳期母乳MFG粒径和ζ电位的研究较少，对不同泌乳期母乳与山羊乳主要功能性FA及MFG物理结构的差异也鲜有系统性地研究，尤其是对功能性FA中DHA的最佳补充水平还鲜有研究；同时，对MFG物理结构与FA含量之间的相关性分析也较少。因此，本研究测定不同泌乳期母乳与山羊常乳中主要功能性不饱和FA的相对含量，并比较不同泌乳期母乳与山羊乳MFG物理特性的差异，与FA相对含量进行相关性分析，深入了解母乳不同泌乳期及山羊乳脂肪结构和主要功能性FA的组成差异，为FA母乳化的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳采集：母乳样本在吉林省松原市根据文献[2]中具体采样方案进行采集，采集后的样品于-20 ℃冷冻保存，待检。山羊乳采集：研究对象为健康的纯种奶山羊，在黑龙江哈尔滨地区由专业养殖人员根据文献[2]中具体采样方案进行采集，样品置于-20 ℃的冷冻箱中，待检。

甲醇、乙醚、石油醚、乙醇 北京索莱宝科技有限公司；焦性没食子酸、正己烷、尼罗红、氯化钠、氢氧化钾 天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

3K15台式冷冻离心机 德国Sigma公司；PS-60AL超声波清洗器 深圳市深华泰实业有限公司；68523气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司；N100氮吹仪 上海精密仪器仪表有限公司；Mastersize 2000激光散射粒度分析仪、Nano-Z电位仪 英国马尔文公司；激光共聚焦显微镜 德国蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 样品分组

初乳为1～7 d母乳（n＝15），过渡乳为7～14 d母乳（n＝15），成熟乳为超过14 d母乳（n＝20），山羊乳为常乳（n＝20），其中n表示样品数。

1.3.2 乳中脂肪质量浓度和FA相对含量的测定

采用巴布科克法（AOAC 989.04）测定母乳与山羊乳脂肪的质量浓度。

参考Folch等[9]的方法提取乳中的脂肪。参考Kelly[10]、王存芳[11]等的碱催化法对乳脂肪进行前处理，用面积归一化法定量。

色谱柱为HP-5MS（质量分数5%苯甲基硅烷）弹性石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），氦气流速为0.8 mL/min。起始柱温为40 ℃，保持2 min；首先以8 ℃/min升到200 ℃；然后以3 ℃/min升到215 ℃；最后以10 ℃/min升到230 ℃，保持7 min；280 ℃后运行2 min。进样量为10 μL，分流比为30∶1。进样口温度260 ℃，检测器温度280 ℃。电子轰击离子源；离子源温度为230 ℃，扫描范围为33～450 u，能量为70 eV。用Xcalibur软件处理数据，未知化合物与NIST谱库（包含107 000 种化合物）相匹配，仅报道正反匹配度均大于80的鉴定结果。

1.3.3 MFG粒径、ζ电位测定

分别量取乳样10 mL。用Mastersize 2000激光散射粒度分析仪测定MFG的粒径和分布。MFG在466 nm和633 nm波长处的折光指数分别为1.460和1.458。颗粒吸收率0.1，遮光度10%～20%。

分别取乳样10 μL，用蒸馏水稀释1 000 倍体积，用Nano-Z Zeta电位仪在25 ℃条件下测定ζ电位。

1.3.4 MFG微观结构观察

分别取原料乳1 mL，向样品中加入10 μL的尼罗红，混合样品，对乳样中的中性脂质进行标记。将混合样品室温下避光放置30～40 min，将标记的样品与5 g/L琼脂糖（贮存在45 ℃）等量混合，将15 μL混合物取出至载玻片上，采用He-Ne激光器在488 nm与543 nm波长处激发尼罗红荧光探针，使用63×1.4 倍的油镜物镜。

1.4 数据统计与分析

所有实验均进行3 次平行测定，结果以平均值±标准差表示。所得数据应用Excel、SPSS软件计算平均值、方差及相关性，采用单因素方差分析法分析差异显著性。采用Origin 8.5软件和Excel软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 母乳与山羊乳功能性FA差异分析

2.1.1 母乳与山羊乳脂肪质量浓度

在婴儿从出生到断奶的喂养过程中，母乳中微量和宏量营养素组成都会随母亲的饮食习惯变化有所波动[12]。在乳的基本化学成分中，脂肪质量浓度的变化幅度最大[13]。母乳中脂肪质量浓度随着泌乳期的延长显著增加（P＜0.05），由初乳时的（26.7±3.6）g/L上升至过渡乳期的（33.7±4.6）g/L，又显著增加至成熟乳期的（41.0±6.8）g/L。这与Martysiak-Zurowska等[13]的研究结果一致。山羊乳中脂肪质量浓度为（42.1±4.3）g/L，显著高于母乳初乳和过渡乳（P＜0.05），但与成熟乳没有显著性差异。王风梅等[14]报道萨能奶山羊乳和荷斯坦牛乳中的脂肪质量浓度分别为40.4、35.5 g/L，陆东林等[15]报道山羊乳、牛乳、牦牛乳、绵羊乳、马乳脂肪相对含量分别为4.5%、3.8%、6.5%、7.2%、1.6%，可以看出，与其他乳相比，牛乳和山羊乳脂肪相对含量与母乳最为接近。

2.1.2 母乳与山羊乳功能性FA组成分析

表1 母乳、山羊乳主要功能性FA的相对含量Table 1 Relative contents of major functional fatty acids in breast milk and goat milk%

母乳中功能性FA主要包括n-9、n-6和n-3多不饱和脂肪酸3 个系列。通过表1可以看出，母乳与山羊乳中主要功能性FA相对含量有很大不同，母乳中富含LA、α-亚麻酸（alpha-linolenic acid，ALA）、ARA、DHA和EPA，这几种FA对降低婴儿体内胆固醇含量、促进大脑与视力的发育等方面都具有重要作用，在母乳中的相对含量显著高于山羊乳。油酸相对含量在母乳3 个泌乳期没有显著变化（P＞0.05），分别为32.27%、32.12%、30.53%，但是显著高于山羊乳（20.79%）。LA相对含量在母乳初乳、过渡乳和成熟乳中分别为20.07%、19.76%、21.73%，在山羊乳中为4.43%，差异显著（P＜0.05）。LA可降低婴儿血液中胆固醇含量，其相对含量是评价FA营养价值的一个重要指标。ARA相对含量在初乳、过渡乳、成熟乳中相对含量分别为0.89%、0.71%、0.66%，在山羊乳中为0.15%，显著低于母乳（P＜0.05）。对国内外几种不同品牌的婴儿配方奶粉中FA组成的研究发现，婴幼儿配方奶粉中ARA相对含量在0.02%～0.67%之间[1,16]，与母乳比较，其相对含量严重不足。ARA是类花生酸的前体[17]，是参与调节免疫功能和血小板聚集的局部介质。所以，在设计研究山羊乳婴幼儿配方奶粉配方时要注意ARA的补充。ALA相对含量在母乳成熟乳期最高（1.66%），而山羊乳中相对含量极少，仅为0.05%。对比母乳与山羊乳EPA相对含量发现，母乳中EPA相对含量在初乳期最高，为1.42%，显著高于山羊乳（0.18%），可达山羊乳的7.8 倍。DHA相对含量在母乳的成熟乳中最低，为0.35%，是山羊乳的2.69 倍，其对于婴幼儿神经系统的发育十分重要[18]。所以，在以山羊乳为基质的婴幼儿配方奶粉中，应该强化ALA、EPA及DHA的相对含量。

2.2 母乳与山羊乳MFG物理特性分析

2.2.1 粒径分析

脂肪球的粒径是判断乳浊液稳定性的重要指标，脂肪球粒径越大稳定性越低。此外，MFG的粒径对乳脂的消化吸收及营养价值也有一定的作用[19]。从表2可以看出，母乳不同泌乳期MFG粒径发生改变，初乳MFG具有最大的体积平均粒径（（5.63±0.51）μm），过渡乳期最小，为（4.21±0.35）μm，成熟乳期为（4.66±0.23）μm。然而，Rüegg等[20]报道，母乳MFG的体积平均粒径随着泌乳期的延长而增大，从初乳的1.74 μm增大到成熟乳中的4.10 μm，与本研究结果不同，这可能是饮食习惯、生活方式、人种不同等因素所致。山羊乳体积平均粒径为（3.63±0.31）μm，比母乳小。文献[21]报道，山羊乳MFG粒径比母乳小，范围在2.57～3.25 μm，与本研究结果一致。母乳初乳MFG粒径不大于（4.87±0.34）μm和（9.87±0.31）μm的颗粒体积分数分别为50%、90%，高于过渡乳、成熟乳及山羊乳。

MFG粒径影响乳的热稳定性、起泡特性、胶凝行为和感官知觉[21-25]。山羊乳的MFG粒径小，MFG不易聚集在一起，可以使乳脂肪稳定地分散在乳胶体溶液中，但是也反映出山羊乳脂肪分离难度比母乳大。从物理角度来看，根据拉普拉斯方程（ΔP＝4γ/d，其中：ΔP是曲面两侧之间存在的压力差/Pa；γ是界面张力/（N/m）；d是颗粒的直径/μm），在界面张力一定时，d越小ΔP越大，因此MFG在乳加工过程中被破坏的灵敏度取决于其粒径，对于粒径较大的MFG而言，其灵敏度会增加。在机械压力下，山羊乳比母乳MFG具有更高的抵抗变形和聚结的能力。这可能有助于更好地了解乳制品生产过程中MFG的稳定性。

图1 不同泌乳期母乳及山羊乳MFG的粒径分布Fig. 1 Particle size distribution of breast milk fat globules at different lactation stages and goat milk fat globules

从图1可以看出，母乳与山羊乳的粒径均呈正态分布。母乳不同泌乳期MFG粒径分布范围差异明显。初乳、过渡乳和成熟乳MFG粒径分布范围分别为0.63～39.91、0.44～13.46 μm和0.79～18.37 μm。初乳粒径分布较宽，过渡乳和成熟乳具有较窄的粒径分布；山羊乳的粒径分布范围为0.48～15.88 μm，窄于初乳和成熟乳。Truong等[22]也报道了类似的结果。母乳初乳和成熟乳都有两个峰，这意味着这两个时期的母乳可能含有两组MFG[26-27]。在乳中不同粒径的MFG具有不同的化学成分，特别是Argov等[27]报道的一些亚微米小球，具有新的代谢和营养功能。不同哺乳阶段母乳MFG的粒径及分布不一致可能与各阶段婴儿生长的特定需求有关。

2.2.2 ζ电位分析

ζ电位可以反映体系中颗粒的带电性和颗粒之间相互作用的强弱，是反映MFG稳定性的重要表征之一，ζ电位（正或负）越高，体系越稳定。自然状态下母乳MFG表面呈负电势，母乳表面电位在初乳期最低（（-5.72±0.21）mV），过渡乳和成熟乳ζ电位分别为（-6.53±0.27）、（-7.76±0.23）mV。随着泌乳时间的延长，ζ电位显著增加（P＜0.05）。山羊乳ζ电位为（-13.69±0.27）mV，显著高于母乳3 个泌乳期（P＜0.05）。不同哺乳期或来自不同物种MFG的ζ电位差异很大程度上归因于MFG膜中极性脂质磷脂、蛋白质和矿物质等含量的不同[28]。

2.3 母乳与山羊乳MFG的微观结构

图2 尼罗红染色观察不同泌乳期母乳及山羊乳MFG中甘油三酯的微观结构Fig. 2 Microstructure of triacylglycerols in human colostrum,transitional, mature milk and goat MFG stained with a Nile Red fluorescent probe

由图2可以看出，母乳与山羊乳MFG均为球状，形态完整，以液滴的形式分散于乳中，红色部分为尼罗红荧光探针染色后呈现的MFG结构，在相同倍数油镜的观察下，母乳不同泌乳期及山羊乳MFG的密度和粒径不同，每毫升原料乳中，山羊乳的MFG颗粒数较多，可以说明山羊乳MFG较小，而母乳初乳MFG体积大于过渡乳和成熟乳。由于样品乳没有经过高压均质等处理，因此可以看到MFG粒径不均一，小的MFG发生了聚集，大的MFG周围吸附有小MFG。此外，尼罗红可通过MFG膜染色小MFG核心中的TAG，表明MFG膜具有一定的渗透性，可以允许一些分子通过。因此，如果小MFG的结构没有受到机械或热损伤，TAG应完全位于脂肪球的核心。

2.4 母乳与山羊乳各指标相关性分析

如表3所示，乳中MFG的ζ电位与脂肪质量浓度呈正相关。随着泌乳期的延长，脂肪质量浓度显著增加，MFG表面电位也显著升高。来自不同哺乳期或来自不同物种MFG的ζ电位差异很大程度上归因于MFG膜中极性脂质、蛋白质及存在于水性环境中矿物质含量的不同[28]，同时，与乳中脂肪质量浓度也有一定的相关性。乳中MFG粒径和脂肪质量浓度也呈正相关，其中山羊乳MFG体积平均粒径与脂肪质量浓度间相关性系数可达0.887（P＜0.05）。Ménard等[29]研究发现水牛和荷斯坦牛乳MFG粒径和脂肪含量也存在相关性（线性相关）。不同乳源MFG体积平均粒径与LA相对含量都呈正相关，但相关性不完全一致，成熟乳中其相关系数为0.945，相关性极显著（P＜0.01），但过渡乳和山羊乳中相关性不显著。不同泌乳阶段大、小MFG的组成成分不同，MFG的结构、组成、泌乳阶段、FA相对含量、脂肪质量浓度之间的相关性也并不完全一致，这可能是个体差异导致的，FA组成与脂肪结构之间的相互作用还有待进一步研究。

表3 母乳与山羊乳中主要功能性FA相对含量、MFG粒径、ζ电位及脂肪质量浓度之间的相关性Table 3 Correlation between relative contents of major functional fatty acids and average particle size of MFG, zeta-potential and fat content in breast milk and goat milk

3 结 论

本研究结果显示，母乳与山羊乳中功能性FA及MFG物理特性存在明显差异，母乳初乳、过渡乳、成熟乳和山羊乳中脂肪质量浓度分别为（26.7±3.6）、（33.7±4.6）、（41.0±6.8）、（42.1±4.3）g/L。母乳中主要功能性FA LA、ALA、ARA、EPA和DHA相对含量显著高于山羊乳（P＜0.05）。其中ALA相对含量在母乳成熟期达到最高，为1.66%，而山羊乳中仅为0.05%。母乳与山羊乳粒径分布均为正态分布，并且观测到完整的MFG结构。母乳初乳MFG具有最大的体积平均粒径（（5.63±0.51）μm）和最低的ζ电位（（-5.72±0.21）mV）。山羊乳MFG体积平均粒径（（3.63±0.31）μm）小于母乳，而ζ电位（（-13.69±0.31）mV）显著高于母乳（P＜0.05），FA相对含量、MFG粒径、ζ电位及脂肪相对含量之间有一定的相关性。因此，在以山羊乳为基质的婴幼儿配方奶粉中应该注意主要功能性FA相对含量以及MFG的结构调整，尤其应该注意增加ARA、EPA、DHA的相对含量。