利用UPLC-MS/MS研究高Amadori化合物番茄粉的制备工艺

张淑琴， 余佳浩， 张连富

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

Amadori化合物是美拉德反应的前期产物。果蔬原料中的葡萄糖、果糖等还原糖物质作为羰基供体，与氨基酸、肽、蛋白质中含有的自由氨基之间发生羰胺缩合反应，经Amadori重排后，形成结构、性质相对稳定的关键中间产物——1-氨基-1-脱氧-2-酮糖，即Amadori化合物组分，也称为酮糖胺组分（Ketosamines），其通用组成式为 Fructose-Amino acid[1]。在果蔬加工或储藏过程中，ACs的检测能够为果蔬的品质变化提供一定的技术指标。除此以外，一些Amadori化合物已被证实具有特定的生理功效[2-10]。由于食品，尤其是富含还原糖和氨基酸的食品，在热加工过程中很容易发生美拉德反应生成Amadori化合物，而Amadori化合物含量的高低又直接影响热加工食品的生理活性，因此研究热加工食品中Amadori化合物的含量变化具有重要意义。

目前，关于Amadori化合物的研究主要集中在不同食品中Amadori化合物含量的测定[11-14]及传统加工贮藏过程中Amadori化合物含量变化的监控上[15-17]，对于如何改进热处理工艺以提高Amadori化合物含量，又达到产品常规指标要求的研究尚未见报道。番茄富含还原糖及氨基化合物，相比于其他水果蔬菜更容易形成Amadori化合物。因此作者选择番茄粉作为试验原料，以8种Amadori化合物的含量为评价指标，探究了水分活度、温度、时间、组氨酸添加量、抗氧化剂添加量对Amadori化合物含量的影响，采用正交试验法对番茄粉热加工工艺进行优化，制备出高Amadori化合物含量的番茄粉，从而为制备高生理活性的番茄制品提供了一种可能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru-Glu）、甲硫氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru-Met）、苯丙氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru-Phe）、丙氨酸与葡萄糖Amadori化合物 （Fru-Ala）、缬氨酸与葡萄糖Amadori化合物 （Fru-Val）、组氨酸与葡萄糖Amadori化合物 （Fru-His）、精氨酸与葡萄糖Amadori化合物 （Fru-Arg）、异亮氨酸与葡萄糖Amadori化合物（Fru-Leu）标准对照品：作者采用化学合成法自制（其结构经红外光谱、三重四级杆质谱及核磁共振表征，纯度均大于98%）；试验用水：Mili-Q超纯水；甲醇、甲酸：美国TEDIA公司产品；番茄粉：实验室自制；C18固相萃取小柱：美国SEPAX公司产品；UPLC-TQD超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱：美国 Waters公司产品；Masslynx 4.1工作站；电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司产品；FZ102型微型植物粉碎机：上海岩征生物科技有限公司产品。

1.2 番茄粉中Amadori化合物检测方法建立

1.2.1 混合标准溶液的配置精确称取8种Amadori化合物，超纯水溶解，定容于50 mL容量瓶中，得到标准储备液。取标准储备液适量并用超纯水稀释定容，按表1配置6种不同质量浓度的混合标准溶液。

表1 标准工作液质量浓度范围Table 1 Concentrations of standards mg/L

1.2.2 UPLC-MS/MS条件液相条件：ACQUITY C18柱。A相：甲醇；B相：体积分数0.1%甲酸水；流量：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；梯度洗脱程序：初始条件为B相100%，1 min到5 min内B相由100%变为90%，5 min到6 min内B相由90%变为50%，6 min到7 min内B相由50%变为100%，7 min之后B相保持100%，总运行时间13 min。进样体积：1 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子电离模式（ESI+），多反应检测模式（MRM），离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：400℃；毛细管电压：2.5 kV；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔电压：30 V；锥孔气流量：50 L/h；碰撞能量：20 V；质量范围：m/z100～1 000；检测电压：1 600 V；高纯氮气（99.999%）。

1.2.3 样品的预处理准确称取4.000 0 g番茄粉于150 ml锥形瓶中，加入5 mL质量浓度为1 mg/L的咖啡因作为内标，同时加入45 mL超纯水，高速震荡30 s，在功率100 W的条件下超声萃取10 min，10 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液过C18固相萃取小柱，净化后的液体用0.22 μm的滤膜，进行UPLC-MS/MS分析。

1.2.4 提取条件的选择准去称取4.000 0 g番茄粉于150 mL锥形瓶中，加入5 mL质量浓度为1 mg/L的咖啡因作为内标，同时加入50 mL超纯水，高速震荡30 s，研究提取溶剂（水、甲醇、乙醇）和提取时间对8种Amadori化合物提取得率的影响。

1.3 高Amadori化合物番茄粉热处理条件优化

1.3.1 热处理单因素试验准确称取10.000 0 g番茄粉于真空包装袋中，真空密封，置于水浴锅中进行加热处理。研究番茄粉水分活度，加热温度，加热时间，氨基酸添加量及抗氧化剂添加量对8种Amadori化合物生成量的影响。以8种Amadori化合物生成量为评价指标，确定加工工艺。

1.3.2 正交试验设计为优化热处理工艺，根据单因素实验结果，选取水分活度，加热温度，加热时间，氨基酸添加量及抗氧化剂添加量为实验因素，设计五因素四水平的正交试验，以8种Amadori化合物总量和Fru-His含量为指标，并进行极差分析，选择最优组合，从而确定最高Amadori化合物及Fru-His含量的番茄粉制备工艺。正交设计试验因素水平见表2。

表2 正交试验表Table 2 Orthogonal experiments

2 结果与分析

2.1 超高效液相色谱质谱标准品的检测结果

2.1.1 8种Amadori化合物混合标准曲线及色谱图将1.2.1中的混合标准溶液在1.2.2的超高效液相色谱质谱条件下检测，图1显示了8种Amadori化合物的MRM色谱图。将目标物与内标峰面积之比（Y）和目标物与内标质量浓度之比（X）进行线性回归分析，得到标准线性方程、相关系数及线性范围，结果见表3。

图1 8种Amadori化合物的MRM色谱图Fig.1 Typical chromatographic profiles of eight ACs using ACQUITY C18 Column with the addition of internal standard（caffeine） under optimization LC-MS-MS conditions

表3 标准回归方程、相关系数和质量浓度线性范围Table 3 Linearity and detection limit

2.1.2 回收率试验采用在番茄粉中加标的方法测定Amadori化合物的回收率。表4显示，回收率86.54%～101.87%，相对标准偏差1.38%～4.49%，表明该方法具有较好的再现性。

2.2 番茄粉中Amadori化合物提取条件优化

2.2.1 提取溶剂对提取得率的影响根据预实验结果，发现超声的提取方式更加省时、高效，因此选择超声的提取方式，对提取溶剂进行了筛选。试验结果如图2所示。从图中可以看出水的提取效果明显高于其他两种溶剂。这可能是因为Amadori化合物作为一种多羟基化合物，具有很强的极性[18]。根据“相似相溶”原理，水的提取效果最好，甲醇次之，乙醇最差，所以选择水为提取溶剂。

2.2.2 提取时间对提取得率的影响由图3可知随着提取时间的增加，Amadori化合物的得率先增大后减小。当提取时间为10 min时，8种Amadori化合物的提取总量最大，除Fru-Met和Fru-Ala以外，其他6种Amadori化合物的质量分数均为最大值。当提取时间过长时，其他6种Amadori化合物会在超声的作用下发生降解，质量分数会有明显的降低，而上述两种Amadori化合物的增加量不显著，因此提取时间应选择10 min为宜。

续表4

图2 提取溶剂对Amadori化合物质量分数的影响Fig.2 Effect of solvent on Amadori Compounds yield

图3 提取时间对Amadori化合物质量分数的影响Fig.3 Effect of extraction time on Amadori Compounds yield

2.3 高Amadori化合物质量分数番茄粉热处理工艺优化

2.3.1 番茄粉水分活度对Amadori化合物质量分数影响由图可知8种Amadori化合物的质量分数均随着水分活度的增加先增大后减小，当番茄粉的水分活度为0.34时，Amadori化合物的质量分数达到最大值。这是因为氨基酸和葡萄糖发生脱水反应，经Amadori重排生成有活性的极性小分子，是一个可逆反应[18]。当番茄粉的水分活度增大时，不利于脱水反应的发生，反应向逆方向进行，Amadori化合物质量分数降低，因此较低的水分活度更有利于Amadori化合物的生成。

图4 水分活度对Amadori化合物质量分数的影响Fig.4 Effect of different water activity on Amadori Compounds yield

2.3.2 温度对番茄粉中Amadori化合物质量分数的影响温度是影响美拉德反应的重要因素，由图5可知，随着温度的上升，8种Amadori化合物的质量分数均有不同程度的增加，当反应温度为60℃时，8种Amadori化合物的质量分数总和达到最大值，同时其中7种Amadori化合物的质量分数均达到最大值。这可能是因为在一定温度范围内，温度的升高有利于提高番茄粉中糖和氨基酸的反应活性，使得Amadori化合物的产量逐渐上升。当反应温度高于60℃时，尽管Fru-Ala的质量分数有微量上升，但其它7种Amadori化合物含量均有显著降低。Amadori化合物作为美拉德反应的前期产物，它的形成和降解是同时发生的，在温度较高的条件下，Amadori化合物的降解速率大于生成速率，会进一步反应生成类黑素等后期产物。故反应温度选择60℃为宜。

图5 温度对Amadori化合物质量分数的影响Fig.5 Effectofdifferenttemperatureon Amadori Compounds yield

2.3.3 时间对番茄粉中Amadori化合物质量分数的影响从图6可以看出随着加热时间的增大，Amadori化合物的含量有一个明显上升的过程，当加热时间超过4 h时，8种Amadori化合物的质量分数均有明显下降，尤其是Fru-Glu和Fru-His的含量显著降低。这可能是因为随着加热时间的增加，Amadori化合物继续参与反应生成类黑素等晚期糖基化产物。故番茄粉的加热时间应选择4 h。

图6 时间对Amadori化合物质量分数的影响Fig.6 Effect of different heating time on Amadori Compounds yield

2.3.4 组氨酸添加量对番茄粉中Amadori化合物质量分数的影响Fru-Glu和Fru-His可以有效抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性[6]。目前，常用抑制ACE的活性来治疗高血压。由试验可知Fru-Glu是番茄粉中的质量分数最高的Amadori化合物，而Fru-His含量较低，因此选择外源添加组氨酸的方法来提高番茄粉中Fru-His的含量，从而提高番茄粉的生物活性。由图7可知，随着组氨酸添加量的不断增加，Fru-His的含量逐渐上升。当组氨酸的添加量为4 mg/g时，8种Amadori化合物的质量分数达到最大值；当组氨酸的添加量大于4 mg/g时，其他7种Amadori化合物的质量分数均有明显的降低。这可能是因为组氨酸的反应活性较高，优先与葡萄糖发生反应，从而使得其他7种氨基酸与葡萄糖发生反应的速率下降。因此组氨酸的添加量为4 mg/g。

图7 组氨酸添加量对Amadori化合物质量分数的影响Fig.7 Effect ofL-Histidine on Amadori Compounds yield

2.3.5 抗氧化剂添加量对番茄粉中Amadori化合物质量分数的影响通过预实验，选择茶多酚作为抗氧化剂来抑制美拉德后期反应的发生。由图8可知，当抗氧化剂的添加量在0～0.06 mg/g时，8种Amadori化合物的质量分数均随着抗氧化剂的增加而增加。这可能是因为茶多酚能够清除美拉德反应中产生的自由基，从而抑制美拉德后期褐色产物的生成，促进前期Amadori化合物的生成[19]。当抗氧化剂的添加量大于0.06 mg/g时，8种Amadori化合物的质量分数随着抗氧化剂的增加而明显降低，尤其是Fru-Glu和Fru-His的质量分数明显降低。这是因为茶多酚的化学结构使其可能会参与美拉德后期产物的形成，当抗氧化剂的质量分数超过一定范围时，反而有利于美拉德后期产物的生成，从而减少Amadori化合物的形成。故抗氧化剂的添加量应选择0.06 mg/g为宜。

2.3.6 正交试验结果与分析根据单因素结果，在正交试验中，考虑到Fru-His的高生理活性，故以8种Amadori化合物总质量分数和Fru-His质量分数为评价指标，考察了各因素对Amadori化合物总质量分数和Fru-His质量分数的影响情况。正交试验设计及结果如表5所示。

图8 抗氧化剂添加量对Amadori化合物质量分数的影响Fig.8 Effect of antioxidants on Amadori Compounds yield

采用综合平衡分析法对结果进行分析。比较表中的极差R值可知，对Amadori化合物总量影响因素主次是E＞B＞C＞A＞D，即关键影响因素为抗氧化剂添加量、温度和时间，其他为次要因素，由K值大小可知因素最优水平组合为B1C3E1；对Fru-His含量影响因素主次是E＞A＞C＞B＞D，即关键影响因素为抗氧化剂添加量、水分活度，由K值大小可知因素最优的水平组合为A4E1。因此较优热处理工艺为A4B1C3E1，由于Amadori化合物总质量分数为相对重要的指标，故因素D选择D1。综上所述分析，最佳的生产工艺应为A4B1C3D1E1，即抗氧化剂添加量为0.048 mg/g，反应温度为54℃，反应时间为4.2 h，水分活度为0.44，组氨酸添加量为2.8 mg/g。

表5 正交试验表及结果Table 5 Design and the results of the orthogonal experiments

2.3.7 验证试验按照A4B1C3D1E1条件进行3次放大平行试验，总Amadori化合物的质量分数均值为152.59 mg/g，Fru-His质量分数为 3.32 mg/g，质量分数均有提高，证明工艺有效。

3 结 语

在利用UPLC-MS/MS方法检测果蔬制品中Amadori化合物含量的基础上，进一步优化了番茄粉的前处理提取条件，研究结果显示以水为提取溶剂，超声提取10 min时，Amadori化合物的提取得率最高。同时探讨了高Amadori化合物番茄粉的制备工艺，以8种Amadori化合物总质量分数及Fru-His的质量分数为评价标准，通过单因素及正交试验分析了影响番茄粉中8种Amadori化合物生成量的因素，进而得到了最佳的热处理工艺：抗氧化剂添加量0.048 mg/g，反应温度54℃，反应时间4.2 h，水分活度0.44，组氨酸添加量2.8 mg/g。在此条件下，总Amadori化合物的质量分数为152.59 mg/g，Fru-His质量分数为3.32 mg/g。该方法为制备富含Amadori化合物的番茄粉奠定了基础。