低苯丙氨酸山杏仁肽的制备

李志刚， 张宇靖， 张 晨， 光翠娥

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122）

苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶 （phenylalanine hydroxylase，PAH）功能障碍或四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）合成酶/二氢生物蝶呤（dihydrobiopterin，BH2）还原酶缺陷而导致的常染色体隐性遗传氨基酸代谢障碍性疾病[1-3]。饮食治疗即控制患者日常饮食中苯丙氨酸摄入量，是目前最主要最有效的治疗方式[4-5]。常见的由除苯丙氨酸外的其他游离氨基酸混合而成的配方食品，气味难以接受，且食用后易造成人体渗透压过高而导致腹泻[6]。采用内肽酶和外肽酶分步水解的方法释放游离苯丙氨酸或产生苯丙氨酸处于末端的肽链，经吸附去除苯丙氨酸后产物可用于为PKU患者制备特殊医学配方食品。最常见最有效的吸附剂为活性炭。

日本学者Yamashita[7]和国内学者周志伟[6]分别以浓缩鱼蛋白和酪蛋白为原料，通过酶法水解再经一定方式分离苯丙氨酸制备了低苯丙氨酸肽。除动物蛋白源外，小麦蛋白[8]、大米蛋白[9]及玉米蛋白[10]等也被用于制备此类肽。

作者以山杏仁蛋白为原料，通过酶法水解吸附苯丙氨酸制备低苯丙氨酸肽，为山杏仁的精深加工提高附加值提供依据，同时为开发低/无苯丙氨酸肽特殊医学配方食品提供原料来源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂山杏仁粗蛋白粉：上海问森生物科技有限公司产品；Alcalase 2.4L、Flavourzyme 1000L （食品级）：丹麦诺维信（Novozymes）公司产品；粉末活性炭：食品级，江苏中远活性炭公司产品。

紫外可见光分光光度计（UV-1600）：上海美普达仪器公司产品；pH计、离心机：梅特勒特托利多（上海）有限公司产品；HS-7集热式电磁搅拌器：IKA产品；K9840智能定氮仪、SH420石墨消解仪：海能仪器产品；DZF-6050电热真空干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；冷冻干燥机：美国Labconoco公司产品；Agilent1100氨基酸专用高效液相色谱系统：美国Agilent公司产品。

1.2 山杏仁蛋白的提取工艺脱脂山杏仁粗蛋白粉→调节pH至9.0→浸提→离心 （4000 r/min，20 min）→取上清液→调节pH至 4.1→离心 （5 000 r/min，15 min）→取沉淀→去离子水清洗→调节pH至7.0→真空冷冻干燥24 h→杏仁蛋白[11]。

1.3 常规成分测定

蛋白质含量测定：GB5009.5—2010[12]，凯氏定氮法；脂肪含量测定：GB/T5009.6—2003[13]，索氏抽提法；水分含量测定：GB5009.3—2010[14]，直接干燥法；灰分含量测定：GB5009.4—2010[15]，550℃高温灼烧法；酶活测定：QB/T 1803—93[16]。

1.4 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的测定

水解度测定采用甲醛滴定法[17]，公式如（1）所示：

式中：C为氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1为所取水解液经甲醛滴定至终点pH 9.2时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2为空白经甲醛滴定至pH 9.2时所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V为水解上清液体积，mL；M为水解样品质量，g；N为样品蛋白质质量分数，%；Htot为每克蛋白质中所含肽键毫摩尔数，对于杏仁蛋白，该值取7.58 mmol/g[18]。

1.5 Flavourzyme 1000L水解单因素实验

配制质量分数5%山杏仁蛋白溶液，添加2 000 U/g Alcalase 2.4 L于60℃、pH 9.0条件下水解2 h后沸水浴灭酶10 min，待冷却后用于外肽酶水解。外肽酶水解后沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min取上清液测定不同条件下DH。

1.5.1 pH对DH的影响于55℃下添加500 U/g Flavourzyme1000L， 分别于 pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5下水解120 min，测定不同pH下的DH。

1.5.2 温度对于DH的影响于pH 7.5、酶添加量为 500 U/g，分别在 45、50、55、60 ℃温度下继续水解120 min，分别测定不同温度下DH的变化。

1.5.3 酶添加量E/S对DH的影响于pH 7.5、55℃的水解条件下， 测定 500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g 酶添加量下水解 120 min后DH的变化。

1.5.4 水解时间对DH的影响于pH 7.5、50℃、酶添加量为3 000 U/g的条件下，分别测定30、60、90、120、150、180 min 不同水解时间的 DH， 确定水解时间。

1.6 Flavourzyme 1000L水解正交实验

通过单因素实验发现，水解120 min后DH基本保持不变，因此采用三因素三水平的正交实验确定Flavourzyme 1000L的最佳水解条件。正交实验设计见表1。

1.7 苯丙氨酸的吸附

经双酶分步水解后水解液6 000 r/min离心20 min，取上清液添加10 g/dL食品级粉末活性炭，于35℃、pH 2.0吸附3 h。

表1 正交实验表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.8 氨基酸组成分析

称取100.0 mg肽粉于水解管内，加入8 mL 6 mol/L盐酸，充氮封管后于120℃水解22 h，水解完成后取出冷却加入4.8 mL 10 mol/L氢氧化钠溶液中和盐酸，再转移至25 mL容量瓶中定容。双层滤纸过滤，取1 mL滤液于1.5 mL离心管内 1 0000 r/min离心10 min，吸取400 μL上清液于样品瓶中进样测定。

液相色谱条件：Agilent Hypersil ODS柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）； 流动相 A （pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃 （体积比为500∶0.11∶2.5）；流动相 B（pH=7.2）：80.9 mmol/L 醋酸钠-甲醇-乙腈（体积比 1∶2∶2）；采用梯度洗脱，洗脱程序：0 min，体积分数 8%B；17.0 min，体积分数 50%B；20.1 min，体积分数 100%B；24.0 min，体积分数0%B；流动相流量为1.0 mL/min；柱温40℃；紫外检测器（VWD）检测波长为 338 nm，脯氨酸于262 nm处检测。

2 结果与分析

2.1 常规成分测定结果

提取所得山杏仁蛋白基本成分见表2。

表2 山杏仁蛋白质基本成分Table 2 Main composition of apricot kernel protein

蛋白酶酶活测定结果见表3。

表3 蛋白酶酶活Table 3 Enzyme activity of different proteases

2.2 Flavouzryme 1000L水解单因素实验

Alcalase2.4L是一种高效的细菌蛋白酶，能够产生大量末端为疏水性氨基酸的肽类，所得水解液往往具有很强的苦味[19]。Flavourzyme 1000 L是一种兼具外肽酶和内肽酶活性的复合蛋白酶，能有效切除肽链末端的疏水性氨基酸[20]，并且能对肽类进行进一步水解，改善水解液的风味。

2.2.1 pH对DH的影响从图1可以看出，在选定的pH值下，随着pH的上升DH逐渐提高，当pH达到7.5左右时DH最大，超过7.5后由于蛋白酶的构象发生变化，水解能力逐渐下降，因此选择pH 7.5为其水解pH。

图1 pH对DH的影响Fig.1 Effect of pH value on DH

2.2.2 温度对DH的影响从图2可以看出，在选择的温度参数下，DH逐渐提高，在50℃左右时水解能力最强，超过50℃后由于高温导致酶的构象发生不可逆的改变，活性开始下降，因此选择50℃为其水解温度。

图2 温度对DH的影响Fig.2 Effect of temperature on DH

2.2.3 酶添加量对DH的影响从图3可以看出，随着酶浓度的上升DH逐渐增大，当添加量增加到3 000 U/g左右时再增加酶浓度DH上升变缓，这可能是由于酶与底物的作用位点达到饱和状态，再增大酶浓度对于DH的提高贡献有限，因此酶添加量选择3 000 U/g。

图3 酶添加量对DH的影响Fig.3 Effect of enzyme concentration on DH

2.2.4 水解时间对DH的影响从图4可以看出，随着时间的推移，能够被Flavourzyme 1000L水解的位点逐渐减少，水解120 min后能够被继续水解的位点几乎没有，DH变化平缓，因此选择120 min为其水解时间。

图4 水解时间对DH的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH

2.3 Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白最佳条件

正交实验结果见表4。

通过极差分析可知，影响Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白的主次因素为B＞A＞C（pH的影响最显著，温度次之，酶添加量影响最小），最佳因素水平组合为B2A2C2，即水解pH为7.5，水解温度为50℃，酶添加量为3 000 U/g。经测试在此工艺条件下水解120 min DH可达41.23%。

2.4 苯丙氨酸的去除及肽的氨基酸分析

常见的用于分离苯丙氨酸的方法有膜分离法、离子交换法、凝胶过滤法等，而活性炭对苯丙氨酸有着特异性的吸附能力[21]，具有廉价高效的特点，因此选用食品级粉末活性炭去除苯丙氨酸。

双酶分步水解后所得水解液，经活性炭吸附苯丙氨酸后，真空抽滤去除活性炭，旋转蒸发浓缩后真空干燥72 h。氨基酸组成见表5。

表4 正交实验结果Table 4 Results of the orthogonal test

表5 肽粉氨基酸组成Table 5 Amino acid composition of the peptide powder

经计算，苯丙氨酸占总氨基酸质量的0.32%，较山杏仁蛋白所含质量分数5.01%大幅降低，同时也低于周志伟[6]等人利用酪蛋白制备低苯丙氨酸肽中质量分数0.5%。由于活性炭对含苯环氨基酸吸附选择性较差，因此在利用此法生产低苯丙氨酸特殊食品时常常需要添加色氨酸和酪氨酸。此外，由于PKU患者饮食控制严格，导致体内缺乏矿物质和维生素，因此在利用此类肽制备低苯丙氨酸特殊食品时需要添加维生素、矿物质和碳水化合物等。

3 结 语

经过试验，Flavourzyme 1000 L水解山杏仁蛋白的最佳工艺条件为水解温度50℃、pH 7.5、添加量3 000 U/g，水解120 min后DH可达41.23%。双酶分步水解后，水解液经活性炭吸附，最终所得肽粉中苯丙氨酸质量分数为0.32%。用此法所得低苯丙氨酸肽可通过补充部分氨基酸、维生素、矿物质及碳水化合物等为PKU患者制备低苯丙氨酸特殊医学配方食品。