氯化钙-木瓜蛋白酶-碳酸氢钠嫩化体系改善原切牦牛排嫩度

杨鸿基，韩 玲,*，孔祥颖，马君义，张文华，余群力

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.海北州畜牧兽医科学研究所，青海 海北 810200；3.青海百德投资发展有限公司，青海 西宁 810000；4.中卫市夏华清真肉食品有限公司，宁夏 中卫 755000）

随着人们生活节奏的加快，冷链物流技术的不断完善，以及中西方饮食文化的融合，牛排因其独特的风味、简易的烹调方式成为家庭餐桌上的新宠。由于我国牛肉市场的眼肉、脊肉、腰内肉等高档部位牛肉价格昂贵且产量较少，所以大多数厂家采用牛后腿肉为原料，经适当调理制作牛排。牦牛肉属于高蛋白、低脂肪肉类，是具有丰富营养价值的绿色食品[1-2]，也是牛排制作的绝佳原料。但由于其嫩度较低，导致市场上的调理牦牛排相对较少，同时影响了其高值化和高产化的进展。

嫩度是评价牛排品质的决定性因素，嫩化牦牛肉的主要手段是通过使用物理、化学、酶法将肌原纤维弱化或将纤维蛋白水解、斩断。研究表明，当Ca2＋浓度达到0.1 mmol/L时，可以激活钙激活酶，钙激活酶的活性致使蛋白分解，使得肉质变嫩。尽管氯化钙对肉的嫩化效果较好，且成本低，应用价值很高，但氯化钙添加量过大会影响肉的风味和色泽，降低肉的保水性[3-4]。木瓜蛋白酶是一种低特异性巯基酶，其活性中心的半胱氨酸可以快速将纤维蛋白的—CO—NH—切开[5]，与Ca2＋的嫩化途径有一定区别。但木瓜蛋白酶的过量使用会导致肉发生过度水解，造成保水性降低，感官评分下降等问题[6]。木瓜蛋白酶的最适pH值在6.0～7.0之间，牦牛肉在宰后24 h之后的pH值稳定在5.60左右[7]。碳酸氢钠能适当提升牛肉pH值，使木瓜蛋白酶达到其作用的最适pH值，同时其作为一种常见的膨松剂和保水剂[8]，还可以适当提升牦牛肉的保水性。国内外很多学者对氯化钙和木瓜蛋白酶嫩化肉的效果进行了大量的研究[9-12]，但关于氯化钙、木瓜蛋白酶及碳酸氢钠复合使用鲜有报道。

本研究通过响应面回归设计，以氯化钙、木瓜蛋白酶和碳酸氢钠为嫩化手段对牦牛排进行嫩化处理，以剪切力和感官评分为评价指标，研究氯化钙、木瓜蛋白酶和碳酸氢钠复合嫩化牦牛排的最佳条件，构建有效的复合嫩化体系，为牦牛肉的增值和增产提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛肉采自青海百德食品有限公司经检疫合格后的4 岁牦牛，屠宰后排酸3～4 d取其后腿肉，剔除筋膜及脂肪，-20 ℃冷冻备用。

氯化钙 浙江大成钙业有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力为100 000 U/g） 南宁东恒华道生物科技有限责任公司；碳酸氢钠 山东海天生物化工有限公司；食盐 甘肃武阳盐化有限公司。以上试剂均为食品级。

K2HPO4、KH2PO4、KCl、EDTA、MgCl2天津市光复科技发展有限公司；NaN3天津市凯信化学工业有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TA.XY Plus物性测试仪 英国Stable Micro System公司；JJ-2B型组织捣碎机 金坛市医疗仪器厂；TGL-16M型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；HTP-250型锯骨机 诸城市和义机械有限公司；CR-10型色度计 柯尼美能达有限公司；ANB-135A电饼档永康市爱宁电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

1.3.1.1 嫩化剂配制

按肉质量的10%配制嫩化剂，其中氯化钙质量浓度分别为0、5、10、15、20、25 mg/mL；木瓜蛋白酶活力分别为0、5、10、15、20、25 U/g；碳酸氢钠质量浓度分别为0、10、20、30、40、50 mg/mL。

1.3.1.2 腌制嫩化

原料沿垂直肌原纤维方向切分为厚度1.2 cm，大小约9 cm×9 cm的原料排，4 ℃解冻。将预先配制好的嫩化剂采用机械注射的方式均匀地注射到肉中，注射量偏差范围在5%之内，然后放置于4 ℃环境中进行腌制，采用间歇式滚揉方式：30 min-30 min-30 min，5～8 r/min。

1.3.1.3 煎制

将嫩化好的样品在温度升至160 ℃的煎锅中煎制，用电子数显食品温度计测定牦牛排中心温度，待温度达到76.6 ℃时取出冷却至室温待测。

1.3.2 剪切力测定

参照马娅俊[13]的方法并稍作修改。样品冷却后切成3 cm×1 cm×1 cm长方体进行测试，每个样品测6 次取其平均值。使用物性测试仪进行测试，测前和测中速率均为10 mm/s，测后速率5 mm/s，触发力5 g，下行距离12 mm。

1.3.3 肉色测定

参照孙志昶[14]的方法，用色差仪进行肉样的L*（亮度值）、a*（红度值）、b*（黄度值）的测定，平行测定3 次，取平均值。从肉样上切取0.5 cm厚切片，在空气中暴露45 min，在切面上选取5 个点用色度计测定色度，结果以CIE系统坐标的L*、a*、b*表示。

1.3.4 肌原纤维断裂指数（myofibril fragmentation index，MFI）测定

参考Delgado等[15]的方法并稍作修改。取腌制后的肉样2 g，加20 mL的MFI缓冲液（20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.1）混合均匀后，在冰水浴下进行匀浆（8 000 r/min，匀浆时间15 s/次，间隙30 s，连续3 次）。匀浆液4 ℃、1 000×g离心15 min，弃上清液。沉淀用8 mL的MFI缓冲液悬浊、再离心，弃上清液。沉淀用5 mL的MFI缓冲液使之重新处于悬浊态，用200 目尼龙筛网过滤该悬浊液，另用5 mL MFI缓冲液帮助肌原纤维蛋白通过滤网。过滤所得的肌原纤维蛋白悬浊液用双缩脲法测定其蛋白含量，然后用MFI缓冲液将其质量浓度稀释至0.5 mg/mL，在540 nm波长处测定其吸光度，MFI缓冲液作对照，将结果乘以200，即为MFI。

1.3.5 感官评价

参考GB/T 14195—1993《感官分析 选拔与培训感官分析 优选评价员导则》[16]选拔、培训10 名优选评价员对牦牛排进行感官评价，参照王永祥[17]的方法并略作修改，具体评价指标见表1。使用强制决定法来确定各因素的权重分配方案。计算公式如下：

感官评分＝0.174×色泽＋0.168×组织状态＋0.182×香气＋0.252×嫩度＋0.224×滋味

表1 感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of yak steak

1.3.6 响应面试验设计

以氯化钙质量浓度（A）、木瓜蛋白酶活力（B）、碳酸氢钠质量浓度（C）和腌制时间（D）为自变量进行单因素试验。根据单因素试验结果，以剪切力（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，用Design-Expert 8.06进行响应面试验设计。试验各因素与水平见表2。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Code and level of independent variables used for response surface optimization

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 22对实验结果进行均值差异显著性检验：P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。多重比较采用最小显著差异法。数据以样品测定结果的表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 各因素对牦牛排嫩化效果的影响

图1 各因素对牦牛排嫩化效果的影响Fig. 1 Effects of calcium chloride concentration, papain activity,sodium bicarbonate concentration and treatment time on tenderization of yak steak

由图1可知，当氯化钙质量浓度在0～10 mg/mL时，牦牛排的剪切力随着氯化钙质量浓度的增加而显著降低（P＜0.05），而MFI值则与氯化钙质量浓度呈极显著正相关，相关系数为0.495。氯化钙质量浓度在10～20 mg/mL时，剪切力显著增加（P＜0.05），20 mg/mL后趋于平缓，而MFI值则先下降再略有回升，各浓度梯度之间的MFI值变化不显著（P＞0.05）。但氯化钙的添加量并非越大越好[18]，试验发现氯化钙质量浓度大于20 mg/mL后，牦牛排的色泽及组织状态被破坏的较为严重，出品率也略有下降。酶活力在0～15 U/g范围内，剪切力随肉中木瓜蛋白酶活力的增加而显著降低（P＜0.05），MFI值则呈现显著增加的趋势，直至酶活力为15 U/g时趋于稳定。实际中发现当酶活力为25 U/g时，剪切力均值下降为1.742 kg，此时牦牛排的外观和组织状态被损坏，口感较差，出现了过度嫩化现象。碳酸氢钠质量浓度在0～10 mg/mL范围内时，剪切力稍有上升，但变化不显著（P＞0.05），MFI值显著下降（P＜0.05）；碳酸氢钠质量浓度为10～20 mg/mL时，牦牛排的剪切力显著降低（P＜0.05），MFI值显著提高（P＜0.05）；碳酸氢钠质量浓度大于20 mg/mL时，剪切力和MFI值均趋于平缓。复合嫩化液的腌制时间在0～12 h范围内，剪切力随着时间的延长而显著降低（P＜0.05），MFI值则显著上升（P＜0.05）。

2.1.2 各因素对牦牛排色泽的影响

图2 各因素对牦牛排色泽的影响Fig. 2 Effects of calcium chloride concentration, papain activity, sodium bicarbonate concentration and treatment time on color of yak steak

由图2可知，氯化钙质量浓度在0～5 mg/mL时，牦牛排的a*值显著下降（P＜0.05），L*和b*值变化不显著（P＞0.05）；其在5～15 mg/mL时，L*、a*、b*值差异不显著（P＞0.05）；而当其大于15 mg/mL时，牦牛排的a*值显著降低（P＜0.05），这可能是由于氯化钙溶液的注射改变了肌动蛋白与肌浆球蛋白之间的相互作用，使肉对光的散射作用发生改变[19]。木瓜蛋白酶活力为0～10 U/g时，牦牛排的L*、a*、b*值均无显著变化（P＞0.05）；酶活力为10～25 U/g时，L*、a*、b*值均呈现先下降后上升的趋势，这可能是因为酶溶液的添加影响了脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白的比例[20]。但综合以上，木瓜蛋白酶对肉色泽的影响较小。碳酸氢钠质量浓度在0～10 mg/mL时，牦牛排的L*和b*值呈现显著下降的趋势（P＜0.05）；碳酸氢钠质量浓度大于10 mg/mL时，L*值先上升然后趋于平缓，a*值持续下降，b*值则是先趋于稳定然后开始下降。碳酸氢钠溶液的添加提高了牦牛排的pH值，增强了线粒体中细胞色素氧化酶的活性，导致鲜红色的氧合肌红蛋白转变为紫红色的脱氧肌红蛋白，肌肉呈暗红色[21]。腌制时间在0～12 h时，随着腌制时间的延长，肉中的氧合肌红蛋白被腌制剂氧化为高铁肌红蛋白，致使牦牛排的L*值先上升后下降，b*值显著升高（P＜0.05），腌制时间大于12 h时，牦牛排的L*、a*、b*值均趋于稳定，腌制剂不再对肉的色泽产生影响。

综合图1和图2考虑，最终选取氯化钙质量浓度10 mg/mL、木瓜蛋白酶活力15 U/g、碳酸氢钠质量浓度20 mg/mL和腌制时间12 h作为响应面的中心点。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken试验结果及模型的建立

根据单因素试验结果，选取氯化钙质量浓度（A）、木瓜蛋白酶活力（B）、碳酸氢钠质量浓度（C）和腌制时间（D）进行4因素3水平的Box-Behnken响应面分析试验，试验设计及结果见表3。运用Design-Expert 8.06对表中的数据进行二次多元回归拟合，分别得到剪切力（Y1）和感官评分（Y2）与4 个嫩化因子A、B、C、D的关系为：

Y1＝4.963 81-0.178 49A-0.292 5B-0.012 06C＋0.018 796D＋0.006 36AB＋0.000 63AC-0.001 912 5AD-0.003 03BC-0.004 95BD-0.001 9CD＋0.004 222 67A2＋0.011 678B2＋0.001 741 92C2＋0.004 488 54D2

Y2＝-10.094 56＋0.429 99A＋0.767 06B＋0.245 33C＋0.727D＋0.002 35AB-0.000 04AC＋0.001 387 5AD-0.001 18BC＋0.001 987 5BD＋0.000 118 75CD-0.024 389A2-0.026 679B2-0.005 521 08C2-0.031 694D2

表3 牦牛排嫩化的Box-Behnken试验结果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 多元回归模型分析

由表4可知，在本试验设计的因素水平范围内，方程的一次项中A、B、C、D对Y1的影响不显著（P＞0.05），A对Y2的影响显著（P＜0.05），B、C、D对Y2的影响极显著（P＜0.01）；二次项B2、C2对Y1的影响极显著（P＜0.01），A2对Y1的影响显著（P＜0.05），D2对Y1的影响不显著（P＞0.05），A2、B2、C2、D2对Y2的影响极显著（P＜0.01）；交互项中，AB、BC对Y1的影响显著（P＜0.05），对Y2的影响极显著（P＜0.01），AC、AD、BD、CD对Y1和Y2的影响均不显著（P＞0.05）。因此，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

由表4可知，两个回归模型均为极显著水平（P＜0.01）且失拟检验不显著（P＞0.05），决定系数R2分别为0.858 1和0.996 4，校正决定系数R2Adj为0.816 1和0.992 8，证明模型与实际结果拟合良好；离散系数表示试验的精确度，数值越大，表明试验的可靠性越差[22]，本试验Y1和Y2模型的离散系数值分别为5.28%和1.06%，说明模型能较好的反应真实值。总体而言，回归模型能够准确分析和预测复合嫩化体系下牦牛排的剪切力和感官评分。

表4 牦牛排嫩化二次多项式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial models

2.2.3 响应面试验中各因素的交互效应分析

响应面图是响应值与各因素所构成的三维空间曲面图[23]。响应面图曲面坡度陡峭、等高线密集成椭圆形表示两因素交互影响大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反[24]。根据得到的二次多项式回归方程，利用Design-Expert 8.06对表4中的数据进行多元回归拟合，得到交互作用的响应面图。

由图3可知，剪切力最低的点位于等高线的中心区域。在选定的因素水平范围内，4 个因素对Y1的影响均不显著（P＞0.05）。当C和D分别为20 mg/mL和12 h时，A与B的交互作用对Y1有显著影响（P＜0.05），Y1呈现明显的先降低后升高的趋势；当A和D固定为10 mg/mL和12 h时，B和C的交互作用显著影响（P＜0.05）剪切力，响应面呈现先迅速下降后缓慢回升的趋势；其余4 组的交互作用对剪切力并无显著影响（P＞0.05）。总体可知，当3 个因素数值一定时，变量因素呈现较为明显的先升后降的趋势。

图3 各因素对剪切力影响的响应面图Fig. 3 Response surface graphs showing the interactive effect of various factors on shear force

图4 各因素对感官评价得分的响应面图Fig. 4 Response surface graphs showing the interactive effect of various factors on sensory evaluation score

由图4可以看出，当碳酸氢钠质量浓度和腌制时间固定为20 mg/mL和12 h时，A与B的交互作用极显著影响（P＜0.01）牦牛排的感官评分。氯化钙质量浓度较低时，腌制剂对肉的嫩化作用不明显，而氯化钙溶液的添加量过大时，肉的pH值下降，使得木瓜蛋白酶的作用效率下降，肉的嫩度变差，感官评分下降。当氯化钙质量浓度和腌制时间固定为10 mg/mL和12 h时，B和C的交互作用对感官评分有极显著影响（P＜0.01），这可能是由于碳酸氢钠溶液通过调节腌制剂的pH值影响了木瓜蛋白酶的作用效率，从而降低了肉的感官评分。其他交互作用的影响不显著（P＞0.05）。从图4也可知，有3 个因素固定时，感官评分随另一个因素的增加而增加，达到最高点后急剧下降。

剪切力越低，感官评分越高，证明复合嫩化体系越显著地改善了牦牛排的嫩度。因此，选定剪切力低和感官评分高为条件联立两个方程并对各变量求导，得出各因素嫩化牦牛排的最佳使用量为：氯化钙质量浓度10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力14.94 U/g、碳酸氢钠质量浓度20.95 mg/mL、腌制时间12.32 h。在此条件下，牦牛排的剪切力预测值为1.758 kg，感官评分预测值为4.67。

2.3 验证实验

为证实结果能有效的改善牦牛排嫩度，对得到的最佳嫩化条件处理牦牛排，并做6 次平行实验。最终得到的实际结果为：剪切力1.801 kg，感官评分4.61；相对偏差分别为2.45%和1.07%。证明本实验得出的结果可以显著改善牦牛排的嫩度，而且避免了氯化钙或木瓜蛋白酶过量使用而引起的肉质、色泽被破坏等问题，有很好的应用前景。

3 讨论与结论

嫩化剂使用一直是肉类研究领域的热点。作为一种常见的盐类，氯化钙主要通过增加肉中Ca2＋浓度改善牦牛肉的嫩度。牛肉细胞中含有可分解肌原纤维蛋白的酶，它的活性由Ca2＋调控，随着Ca2＋浓度的增加，钙激活酶的活性中心暴露，活性增加，降低内源蛋白酶激活中性蛋白酶抑制剂的活性，从而使α-肌动蛋白从Z线消失。钙激活酶还可降解其他蛋白，使肌肉的伸张力减弱，促进粗细肌微丝释放游离[25]，肉质变嫩。但有研究表明，Ca2＋浓度过大时，反而会抑制酶的活性，而且使肉的色泽变差，失水严重，感官评分下降。从本研究可以看出，氯化钙使用量较少时，可以明显改善牦牛排嫩度；但用量大于15 mg/mL时，肉的剪切力略有回升，感官评分下降严重，可能是因为高浓度盐使得肉样失水严重，保水性下降，嫩度变差[26]。而木瓜蛋白酶是一种天然生物酶制剂，其作用主要集中于Z线上，使Z线断裂，肌原纤维出现小片化。因木瓜蛋白酶和氯化钙的嫩化途径不同，其和氯化钙复合使用时，可以有效地降低氯化钙的用量，在改善嫩度的同时保持牦牛排色泽、多汁性及组织状态不受破坏。但一些研究发现，木瓜蛋白酶的过量使用，会使肉老化严重，风味出现异常[27-28]。通过本实验也发现，当木瓜蛋白酶的用量大于20 U/g时，牦牛排的感官评分急剧下降，剪切力也开始回升，这可能是由于酶的增加导致肌原纤维间的空隙太大而不能保持水分。碳酸氢钠不仅能提高肉的持水力，其溶解于水中呈现的弱碱性还可以适当提高牦牛肉的pH值，提高木瓜蛋白酶的嫩化效率，降低酶用量。本研究也发现，通过氯化钙、木瓜蛋白酶和碳酸氢钠的复合使用，不仅改善了牦牛排的嫩度，还稳定了色泽和组织状态等感官指标。

牦牛排嫩化效果的评价指标也会影响各因素使用条件的筛选[27]。本研究还选取了MFI作为条件优化的验证指标。MFI值越高，表明肌原纤维小片化程度越高，肉的嫩度越好。本研究的目的是改善牦牛排嫩度的同时提升消费者的感官感受，过于追求剪切力的降低和MFI值的提升可能会适得其反。因此，在优化牦牛排嫩度的同时必须引入色度变化和感官评分这一指标，通过色泽、风味、组织状态等因素的变化来改正由于剪切力过低造成的品质降低问题，确保实验得出的最佳优化工艺具有实际意义。

氯化钙、木瓜蛋白酶或碳酸氢钠单独作为肉制品嫩化剂的研究较多。杨敏等[29]在4 ℃条件下用氯化钙溶液浸泡处理宰后牦牛肉，以剪切力和MFI值为评价指标，确定在氯化钙质量分数4%、处理时间2 d时可以获得最佳的嫩化效果。Milligan等[30]给牛大腿内侧肌肉注射氯化钙溶液，结果显示肉的嫩度与口感较对照组明显提高。此外，李劼等[31]采用不同碳酸氢钠浓度对牛肉进行处理，证明肉质量的0.4%碳酸氢钠处理对酱牛肉的嫩化有一定效果。许道光等[8]分析了不同氯化钠和碳酸氢钠复合处理对牛肉品质的影响，结果显示5%氯化钠和5%碳酸氢铵溶液的组合能明显增加肉的嫩度，降低失水率。Kemp等[6]探究了单独使用木瓜蛋白酶的最佳条件。本研究表明，在氯化钙、木瓜蛋白酶和碳酸氢钠复合使用下，氯化钙质量浓度10.19 mg/mL、酶活力14.94 U/g、碳酸氢钠质量浓度20.95 mg/mL时，剪切力、MFI值和感官评分最佳。与上述研究对比，本实验中氯化钙和木瓜蛋白酶的用量分别下降了74.53%和70.12%，这主要是因为三者的复配使用，能够通过不同的嫩化途径改善牦牛排的嫩度，大大提高了嫩化效率，提高了肉的感官评价得分。通过建立氯化钙、木瓜蛋白酶和碳酸氢钠三者相结合的嫩化体系，不仅避免了由于氯化钙和酶使用过量而造成的肉质变老，风味异常等问题，还节约了嫩化成本。

综上可知，氯化钙、木瓜蛋白酶和碳酸氢钠的复配使用可以明显改善原切牦牛排嫩度。本研究通过响应面回归设计最终确定的最佳嫩化条件为：氯化钙质量浓度10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力14.94 U/g、碳酸氢钠质量浓度20.95 mg/mL、腌制时间12.32 h。此条件下，剪切力预测值为1.758 kg，感官评分预测值为4.67，整体上较满意，且验证结果与预测值拟合良好。本试验体系还降低了氯化钙和木瓜蛋白酶的用量，提高了产品的感官评分，为工厂大规模生产牦牛排提供了有效依据。