胃、肠消化后猪肝酱中铁和锌的形态分析

张建萍，蔡望秋，陈尚龙，陈安徽，李 超

（1.徐州工程学院 食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221018；2.徐州工程学院 江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018）

Fe和Zn都是人体必需的微量元素[1]，众所周知，长期缺Fe或Zn对人体健康具有较大的危害[2]。猪肝系列产品中含有丰富的Fe和Zn，之前的研究以测定Fe和Zn总量为主，对其形态分析较少[3]。相关研究报告表明[4-7]，人体对微量元素的吸收与其形态密切相关，与无机态相比，有机态的金属元素更易被人体吸收。近年来，随着对微量元素研究的深入，已有一些形态分析研究报道，MEI T等[8]利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术发现，金针菇水溶性蛋白中至少含有6种含硒蛋白，约占总可溶性硒的7.0%；李红卫等[9]利用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，建立高效液相色谱法测定富硒米曲霉中有机硒形态的分析方法，取得了良好的效果。

实验动物模型可以较好的模拟人体消化和吸收的过程，但其成本高、耗时、耗力。本实验以实验室研制的猪肝酱为研究对象，采用体外全仿生消化（含消化酶）技术[10-13]模拟猪肝酱在胃、肠中消化，依据化学仿生（人工胃、肠）与医学仿生（酶的作用）原理，模拟猪肝酱经胃肠环境的转运机制，研究胃、肠所含的无机物、有机物及消化酶对猪肝酱中Fe、Zn形态和生物可给性的影响。利用0.45 μm微孔滤膜分离悬浮态和可溶态，通过D101大孔树脂实现无机态和有机态的分离。微波消解后使用高分辨-连续光源原子吸收光谱（high resolution-continuum source atomic absorption spectrometry，HR-CS AAS）仪[14-18]测定各形态Fe和Zn的含量，为科学补充Fe和Zn提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肝酱：实验室研制产品。

粘液素、牛血清白蛋白、黏蛋白、胰液素、淀粉酶、脂肪酶（均为生化试剂）：上海源叶生物科技有限公司；KCl、KSCN、NaH2PO4、Na3PO4、NaCl、NaOH、CaCl2、NH4Cl、NaHCO3、KH2PO4、MgCl2（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ContrAA 700高分辨-连续光源原子吸收光谱仪（简称HR-CS AAS）：德国Analytik Jena公司；XT-9900型智能微波消解仪、XT-9800多用预处理加热仪：上海新拓微波溶样测试技术有限公司；CascadaTM实验室超纯水系统：美国Pall公司；3-30K台式高速冷冻离心机：德国Sigma公司；L550台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猪肝酱制作工艺流程[19-21]

腌制：将沥水后的猪肝和五花肉加入香料，滚揉腌制30 min。腌制配比：猪肝100 g，五花肉10 g，料酒3 g，葱1 g，姜3 g，蒜3 g，白砂糖2 g。

炒制：将20 g植物油和5 g猪油加入锅中，加热后加入蒜末和姜末，出味后依次加入五香粉、盐、味精、淀粉、糊精等进行炒制，炒制时间为3 min。

炒制配方：猪肝100 g，五花肉10 g，蒜3.75 g，姜3.75 g，五香粉1 g，盐3.75 g，味精0.5 g，淀粉3.5 g，糊精7 g，亚硝酸钠1.2 g，复合磷酸盐1 g。

脱气：将斩拌好的样品真空滚揉10 min。

杀菌：将灌装好的猪肝酱121 ℃杀菌60 min。

1.3.2 仪器工作参数

HR-CS AAS（火焰法）测定Fe和Zn的工作参数见表1。同时进行乙炔流量和燃烧器高度的优化。

表1 HR-CS AAS工作参数Table 1 Working parameters of HR-CS FAAS

1.3.3 样品前处理及其Fe和Zn的测定

参考文献[1]，采用微波消解处理猪肝酱及其胃、肠消化后的样品，根据Fe和Zn的实际浓度，进行适当稀释，最后再使用HR-CS AAS按表1的工作参数测定Fe和Zn。

1.3.4 消化液的制备

参考文献[22]，分别加入唾液、胃液、十二指肠液和胆汁中所含的有机物和无机物，利用HCl和NaHCO3调节pH值，再用超纯水定容至500 mL，置于4 ℃冷藏保存备用，使用前在此基础上分别加入相应的消化酶。

1.3.5 模拟猪肝酱在胃中消化

在50.0 g猪肝酱中添加5.00 mL唾液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡5 min后；再添加75.0 mL胃液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡2 h[22]；结束后将样品转移至适当离心管中，通过离心实现固液分离，称量上清液（猪肝酱胃全仿生消化液）质量。

1.3.6 模拟猪肝酱在肠中消化

在50.0 g猪肝酱中添加5.00 mL唾液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡5 min后；添加75.0 mL胃液，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡2 h；再添加100.0 mL十二指肠液和40.0 mL胆汁，混匀后在37 ℃、60 r/min条件下恒温振荡7 h；结束后将样品转移至适当离心管中，通过离心实现固液分离，称量上清液（猪肝酱肠全仿生消化液）质量。

1.3.7 悬浮态与可溶态的分离和测定

将一定质量的猪肝酱胃全仿生消化液转移至适当离心管中，通过高速离心实现固液分离，再将上清液通过0.45 μm滤膜，悬浮态将被滤膜截留下来，通过的为可溶态[1]，并称其质量。再按1.3.3方法对可溶态样品进行处理和测定。按同样的方法处理猪肝酱肠全仿生消化液。

悬浮态Fe（或Zn）=Fe（或Zn）总量-可溶态Fe（或Zn）

1.3.8 无机态与有机态的分离和测定

参考文献[22]，处理D101大孔吸附树脂，将一定质量的可溶态溶液通过树脂，用体积分数1%的HNO3按一定流速洗涤树脂，再按1.3.3方法对洗脱液样品进行处理和测定，洗脱液样品中Fe和Zn为无机态。

有机态Fe（或Zn）=可溶态Fe（或Zn）-无机态Fe（或Zn）

1.3.9 Fe（或Zn）生物可给性的计算

模拟猪肝酱在胃、肠中消化，Fe（或Zn）生物可给性的计算公式如下：

式中：BA为Fe（或Zn）的生物可给性，%；TK为胃、肠消化液中可溶态Fe（或Zn）含量，μg/g；TZ为猪肝酱中Fe（或Zn）总量，μg/g。

2 结果与分析

2.1 测定参数的优化

使用HR-CS AAS测定Fe和Zn时，利用仪器自带优化功能对不同测定参数进行优化，优化结果见表2。

由表2可知，HR-CS AAS测定Fe的最佳参数为乙炔流量80 L/h，燃烧器高度5 mm；测定Zn的最佳参数为乙炔流量90 L/h，燃烧器高度6 mm。

表2 测定参数的优化Table 2 Optimization of determination parameters

2.2 标准工作曲线的绘制

使用HR-CS AAS测定不同浓度的Fe标准溶液，吸光度值以A表示，Fe标准溶液浓度以c表示，经仪器自带软件绘制，得Fe回归方程为A1=（-0.001 375 2+0.025 587 4×c1）/（1+0.019 396 3×c1），相关系数R2为0.999 5；同理，得Zn回归方程为A2=（-0.018 503+0.131 201 5×c2）/（1+0.128 793 8×c2），相关系数R2为0.999 1；Fe和Zn标准工作曲线的相关系数R2均≥0.999，这表明浓度与吸光度值有良好的关系。

2.3 加标回收率

将一定量Fe、Zn标准溶液和猪肝酱样品一起置于微波消解罐中进行微波消解，按1.3.3方法进行处理和测定，重复6次，计算加标回收率[23]，结果见表3。

由表3可知，Fe平均加标回收率为103.7%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）=1.28%；Zn平均加标回收率为96.8%，RSD=1.58%。这表明按1.3.3方法进行处理和测定，结果准确可靠。

表3 加标回收率测定结果Table 3 Results of adding standard recoveries

2.4 消化液中Fe的形态分析

胃、肠消化后猪肝酱中Fe的形态分析，结果见表4。

由表4可知，猪肝酱含有丰富的Fe，达（112.56±3.13）μg/g；消化前猪肝酱中可溶态Fe为（9.21±0.40）μg/g，占总量的8.18%，其中有机态Fe占总量的1.75%，Fe的生物可给性为8.18%；猪肝酱在模拟胃中消化后可溶态Fe为（21.24±0.52）μg/g，占总量的18.87%，其中有机态Fe占总量的8.02%，Fe的生物可给性为18.87%；猪肝酱在模拟肠中消化后可溶态Fe为（29.22±0.76）μg/g，占总量的25.96%，其中有机态Fe占总量的13.42%，Fe的生物可给性为25.96%。

表4 消化液中Fe的形态分析Table 4 Speciation analysis of Fe in digestive juice

相比消化前，胃消化后除悬浮态Fe，其他各形态Fe的含量都所有增加，生物可给性变大；相比胃消化，肠消化后除悬浮态Fe，其他各形态Fe的含量都所有增加，生物可给性变大；这表明胃、肠消化都是将一部分悬浮态Fe消化成可溶态Fe，其中以有机态Fe为主，有利于人体吸收。

2.5 消化液中Zn的形态分析

胃、肠消化后猪肝酱中Zn的形态分析，结果见表5。

由表5可知，猪肝酱含有丰富的Zn，达（41.38±1.14）μg/g；消化前猪肝酱中可溶态Zn为（8.13±0.36）μg/g，占总量的19.65%，其中有机态Zn占总量的1.81%，Zn的生物可给性为19.65%；猪肝酱在模拟胃中消化后可溶态Zn为（12.48±0.32）μg/g，占总量的30.16%，其中有机态Zn占总量的7.85%，Zn的生物可给性为30.16%；猪肝酱在模拟肠中消化后可溶态Zn为（18.48±0.49）μg/g，占总量的44.66%，其中有机态Zn占总量的16.09%，Zn的生物可给性为44.66%。

相比消化前，胃消化后除悬浮态Zn，其他各形态Zn的含量都所有增加，生物可给性变大；相比胃消化，肠消化后除悬浮态Zn，其他各形态Zn的含量都所有增加，生物可给性变大；这表明胃、肠消化都是将一部分悬浮态Zn消化成可溶态Zn，其中以有机态Zn为主，有利于人体吸收。

表5 消化液中Zn的形态分析Table 5 Speciation analysis of Zn in digestive juice

3 结论

通过单因素试验，确定Fe最佳测定条件：乙炔流量为80 L/h，燃烧器高度为5 mm；Zn最佳测定条件：乙炔流量为90 L/h，燃烧器高度为6 mm。在此条件下，测定猪肝酱中Fe含量为112.56 μg/g，Zn含量为41.38 μg/g。胃、肠消化后除悬浮态Fe和Zn，其他各形态Fe和Zn的含量都有所增加，生物可给性变大，这表明胃、肠消化都是将一部分悬浮态Fe和Zn消化成可溶态Fe和Zn，其中以有机态Fe和Zn为主。