四川地区猪源致病性大肠埃希菌分子分群、生物被膜形成能力及耐药性研究

彭珂楠，周雪珂，殷鑫欢，李 飞，蔡 瑶，曾喻兵，江朝源，张儒博，杨泽晓，徐志文，3，朱 玲，3，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.四川大学 生命科学学院，四川 成都 610044； 3.四川农业大学 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

大肠埃希菌(Escherichiacoli)是一种能引起人畜共患病的革兰氏阴性短杆菌，普遍存在于自然环境中，通过各种途径对畜禽养殖业、食品、水域环境造成严重的污染和经济损失[1]。猪大肠杆菌病是由致病性大肠埃希菌引起的仔猪肠道传染病，常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病3种，以发生肠炎、肠毒血症为特征[2]。实际生产中，常使用抗生素来治疗大肠杆菌病[3]，由于大肠埃希菌易产生耐药性，尤其近年来抗菌药物的广泛使用，使耐药菌株不断增加[3-4]，严重影响养殖业的发展。

细菌生物被膜(bacterial biofilms，BF)是指由细菌自身分泌的多聚基质包裹、能黏附于某种有生命或无生命固体表面的细菌聚集膜样物[5]，能增加细菌定植能力、感染力，提高其对抗生素的耐受性和耐药性。高致病性毒力岛(high pathogenicity island，HPI)最初发现于耶尔森菌中，可在耶尔森菌、大肠埃希菌及沙门氏菌间水平传播[6-8]，是决定细菌致病性和毒力的重要因素之一。HPI毒力岛的主要结构基因包括irp1、irp2和fyuA基因，irp2基因作为铁调节基因，仅存在于强致病株中，与细菌毒力密切相关。由于irp2基因核苷酸序列具有高度保守性，成为用来判断和检测病原菌是否存在HPI毒力岛的标志基因[9-10]。

本试验自2016年至2018年间从四川地区不同养殖场的患病猪体内分离到22株致病性大肠埃希菌，并对其进行分子分群、耐药性和BF形成能力研究，同时对耐药基因类型及3种HPI毒力岛基因携带情况进行检测分析，以期进一步了解四川省猪源致病性大肠埃希菌的分子流行特点，为四川地区猪致病性大肠埃希菌的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

2016—2018年，从四川地区不同养猪场出现消瘦、腹泻、水肿甚至死亡的病猪中，无菌采集肝脏、脾脏、肺脏、肠道等组织样品208份。

1.1.2 主要试剂及试验动物

LB肉汤、麦康凯培养基、MH琼脂培养基、药敏纸片购自四川瑞进特科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Maker、ddH2O购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌DNA提取试剂盒购于TIANGEN公司；8周龄的健康BALB/c小鼠购自达硕公司。

1.2 材料

1.2.1 细菌分离鉴定

样品接种麦康凯培养基，37 ℃培养箱中培养12 h后，观察菌落形态，挑取可疑单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养，37 ℃摇床振荡培养12 h，所有分离株经革兰染色后镜检、生化鉴定和16S rRNA分析鉴定。分离株保存在终浓度30%的甘油肉汤中，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 致病性试验

6只健康小鼠随机分为2组，第1组注射大肠埃希菌菌液，第2组注射生理盐水。挑取单菌落37 ℃、150 r·min-1振荡培养过夜，4 ℃、5 000 r·min-1离心5 min收集菌体，用无菌生理盐水悬浮菌体，试验组小鼠腹腔注射0.2 mL(6×108CFU·mL-1)菌液，对照组腹腔注射等量生理盐水。观察并记录小鼠临床表现及死亡情况，剖检死亡小鼠，并分离细菌。

1.2.3 耐药试验

将22株分离菌以LB肉汤稀释至0.5麦氏单位，用纸片扩散法检测被检菌株对左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、新霉素、丁胺卡那、庆大霉素、链霉素、大观霉素、头孢曲松、氨苄西林、阿莫西林、头孢吡肟、头孢噻肟、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明、多粘菌素B、四环素、多西环素等19种抗菌药的敏感性，按照美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)标准进行结果判定。

1.2.4 生物被膜的形成

参考文献[11]，采用结晶紫微孔板法对分离菌株进行生物被膜的定量检测，每株菌株设4个平行孔，置于酶标仪上检测595 nm下的吸光度值，重复检测3次，取平均值。以阴性对照孔吸光度值的2倍作为判断能否形成生物被膜的临界点Dc。当D≤Dc时，表示细菌形成生物被膜能力为零；当Dc2Dc时，表示细菌形成生物被膜的能力较强。

1.2.5 系统进化分群分析

参考文献[12]方法进行分子分群，设计3对大肠埃希菌分群引物(表1)，采用多重PCR方法对分离菌株进行分群鉴定，用1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照记录结果。

1.2.6 分离菌株耐药基因及毒力基因检测

根据文献[1]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成耐药基因TEM、SHV、OXA、sulⅠ、sulⅡ、acc(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、cmlA、floR、tetA、tetB、qurB及HPI毒力岛基因irp1、irp2、fyuA引物序列(表2)。以22株致病性大肠埃希菌分离株基因组DNA为模板对12种耐药基因及3种HPI毒力岛基因进行PCR扩增，每个基因分别取1株进行胶回收并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与GenBank数据库相应序列进行同源性对比。

2 结果与分析

2.1 大肠埃希菌分离鉴定结果

无菌采集患病猪组织病料进行细菌分离鉴定，结果显示，87株分离菌株在麦康凯培养基上为边缘浅红色中心深桃红色，圆形扁平菌落，边缘整齐，表面光滑湿润；经革兰染色及镜检可见其形态为单个存在的阴性两端钝圆的杆状菌；生化试验发现试验菌株可以发酵乳糖和山梨醇，吲哚和甲基红试验均为阳性，乙酰甲基甲醇试验和枸橼酸盐利用试验阴性，氧化酶试验和硫化氢试验阴性，均符合大肠埃希菌的特点；16S rRNA检测结果可获得1 500 bp的目的条带，经过测序比对均确认为大肠埃希菌。

表1 引物信息

Table1Primers information

检测基因Gene引物序列Primersequences(5′-3′)基因登录号GenBankaccessionNo.产物大小Productsize/bpChuAF:GACGAACCAACGGTCAGGAT;R:TGCCGCCAGTACCAAAGACAU67920.1279YjaAF:TGAAGTGTCAGGAGACGCTG;R:ATGGAGAATGCGTTCCTCAACMH511178.1211TspE4.C2F:GAGTAATGTCGGGGCATTCA;R:CGCGCCAACAAAGTATTACGMH511180.1152

表2 引物信息

Table2Primers information

基因类型Genotype基因Gene引物序列Primersequences(5′-3′)基因登录号GenBankaccessionNo.产物大小Productsize/bpβ-内酰胺类TEMF:ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCC;R:ACCCACTCGTGCACCCAACTGFJ668751118β-LactamSHVF:GCGACAACGTCACCCGCCTT;R:TTGCGAACGGGCGCTCAGACFJ668798132OXAF:ACAGAAGCATGGCTCGAAAGT;R:TTGCTGTGAATCCTGCACCAGQ896560190磺胺类sulⅠF:TCGGACAGGGCGTCTAAG;R:GGGTATCGGAGCGTTTGCAM295981925SulfonamidessulⅡF:TGCCATCCCTGGTCAGAGTGCAG;R:GCAGTCAATGGGCGCAAGCTGTFJ705354179氨基糖苷类Acc(3)-ⅡF:GGCGACTTCACCGTTTCT;R:GGACCGATCACCCTACGAGX13543412Amimoglycosidesaph(3′)-ⅡF:CGTATTTCGTCTCGCTCAG;R:GATTCCGACTCGTCCAACNC009656232氯霉素类cmlAF:GGGTGGCGGGCTATCTTT;R:GCGACACCAATACCCACTAGAJ487033467ChloramphenicolfloRF:GAACACGACGCCCGCTAT;R:TTCCGCTTGGCCTATGAGDQ206638601四环素类tetAF:TTGGCATTCTGCATTCACTCG;R:CCACCCGTTCCACGTTGTTX75761344TetracyclinestetBF:TTCACCGCATAGTCCCTT;R:TGCAATAAATCCGAGCAGV00611388喹诺酮类qurBF:CTATGATCGTGAAAGCCAGAAAGG;NC010943427QuinolonesR:CCGAATATCTAAGTCACCCAACTCCHPI毒力基因irp1F:CCGGTTATTGTGAAGGTT;R:GTGAATGTTACGGCACTAAY12527799HPIvirulenceirp2F:AAGGATTCGCTGTTACCGGAC;R:AACTCCTGATACAGGTGGCL18881414genesfyuAF:GCTTTATCCTCTGGCCTT;R:GGCATATTGACGATTAACGZ35486948

2.2 致病性试验结果

试验组小鼠在接种大肠埃希菌分离株24～48 h后，出现了精神沉郁、食欲减退等症状，逐渐出现死亡。剖检死亡小鼠进行细菌分离鉴定，从小鼠的肝脏中分离到大肠埃希菌，对照组小鼠未出现明显的变化。通过致病性试验统计与分析，共筛选出22株致病性大肠埃希菌。

2.3 药敏试验结果

大肠埃希菌药敏试验结果见表3。由表可知，22株大肠埃希菌对阿莫西林、红霉素、四环素、复方新诺明、恩诺沙星、氨苄西林、氟苯尼考、多西环素、链霉素有较强的耐药性，耐药率均在80%以上；对左氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、头孢曲松4种药物的耐药率为63.64%～72.73%；对新霉素、头孢噻肟、大观霉素、丁胺卡那、头孢吡肟、多粘菌素B的耐药率低于60%，表现出不同程度的敏感性。

2.4 生物被膜形成能力

利用结晶紫染色定量法测定分离的大肠埃希菌生物被膜形成能力，结果显示，22株大肠埃希菌分离株有16株可以形成生物被膜，占分离菌总数的72.73%，其中强成膜能力菌株9株，弱成膜能力菌株7株。

2.5 系统进化分群分析结果

据文献[12]所建立的方法，对22株猪源致病性大肠埃希菌进行分群鉴定。如图1所示，A群大肠埃希菌比例为59.09%(13/22)，B1群大肠埃希菌比例为4.55%(1/22)，B2群大肠埃希菌比例为22.73%(5/22)，D群大肠埃希菌比例13.64%(3/22)。

2.6 耐药基因及HPI毒力岛基因检测结果

22株猪源致病性大肠埃希菌TEM、SHV、OXA、sulⅠ、sulⅡ、acc(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、cmlA、floR、tetA、tetB、qurB等12种耐药基因及irp1、irp2、fyuA等3种HPI毒力岛基因凝胶电泳成像结果见图2。结果显示，15种基因片段大小与目的条带大小一致。从检出的耐药基因型中各取1份阳性PCR扩增产物进行序列测序，测序结果与GenBank收录的对应基因序列同源性均在98%以上。耐药基因及HPI毒力岛基因携带情况见表4。

表3 大肠埃希菌药敏试验结果

Table3Drug sensitive results ofEscherichiacoliisolates

抗菌素Antibiotics耐药Resistant菌株数No.所占比例Proportion/%中介Intermediary菌株数No.所占比例Proportion/%敏感Senstive菌株数No.所占比例Proportion/%喹诺酮类Quinolones左氧氟沙星Levofloxacin1672.7300627.27诺氟沙星Norfloxacin1672.7314.55522.73恩诺沙星Enrofloxacin1986.36313.6400氨基糖苷类Amimoglycosides新霉素Neomycin1254.55418.18627.27丁胺卡那Amikacin627.27313.641359.09庆大霉素Gentamicin1568.1800731.82链霉素Streptomycin1881.8229.0929.09大观霉素Spectinomycin836.36313.641150β-内酰胺类β-Lactam头孢曲松Ceftriaxone1463.64313.64522.73氨苄西林Ampicillin1986.3600313.64阿莫西林Amoxicillin22100.000000头孢吡肟Cefepime627.27418.181254.55头孢噻肟Cefotaxime1254.55940.9114.55大环内酯类Macrolide红霉素Erythrocin22100.000000氯霉素类Chloramphenicol氟苯尼考Florfenicol1986.3614.5529.09磺胺类Sulfonamides复方新诺明Selectrin2090.9129.0900脂肽类Daptomycin多粘菌素BPolymyxinB14.55940.911254.55四环素类Tetracyclines四环素Tetracycline2195.4514.5500多西环素Doxycycline1986.36313.6400

M，DL 2 000 marker；1、8、11-22，A群；14，B1群；2-6，B2群；7、9、10，D群。M， DL 2 000 marker；1, 8, 11-22: A group; 14， B1 group; 2-6， B2 group; 7, 9, 10: D group.

M，DNA Maker DL 2000；1-15:基因1，OXA基因；2，sul Ⅰ基因；3，tetA基因；4，acc(3)-Ⅱ基因；5，aph(3’)-Ⅱ基因；6，cmlA基因；7，floR基因；8，irp2基因；9，qnrB基因；10，fyuA基因；11，irp1基因；12，tetB基因；13，sul Ⅱ基因；14，SHV基因；15，TEM基因。M， DNA Maker DL 2000; 1， OXA gene; 2， sul Ⅰ gene; 3， tetA gene; 4， acc(3)-Ⅱ gene; 5， aph(3’)-Ⅱ gene; 6， cmlA gene; 7， floR gene; 8， irp2 gene; 9， qnrB gene; 10， fyuA gene; 11， irp1 gene; 12， tetB gene; 13， sul Ⅱ gene; 14， SHV gene; 15， TEM gene.

表4 大肠埃希菌耐药基因及HPI毒力岛基因检出结果

Table4Detection of resistant genes and HPI virulence genes inEscherichiacolifrom swine

抗菌素Antibiotics基因Gene阳性菌株数Numberofpositivestrains阳性检出率Positiverate/%β-内酰胺类β-LactamTEM836.36SHV29.09OXA29.09氨基糖苷类Amimoglycosidesacc(3)-Ⅱ1568.18aph(3’)-Ⅱ1150.00磺胺类SulfonamidessulⅠ1463.64sulⅡ2195.45氯霉素类ChloramphenicolcmlA1045.45floR1881.82四环素类TetracyclinestetA1881.82tetB1986.36喹诺酮类QuinolonesqnrB940.91HPI毒力岛基因HPIvirulencegenesirp1940.91irp2313.64fyuA313.64

结果显示，22株猪源致病性大肠埃希菌中，磺胺类耐药基因sulⅡ，四环素类耐药基因tetA、tetB，氯霉素类耐药基因floR携带率均高于80%；氨基糖苷类耐药基因acc(3)-Ⅱ，磺胺类耐药基因sulⅠ携带率也较高；β-内酰胺类耐药基因TEM、SHV、OXA，氨基糖苷类耐药基因aph(3’)-Ⅱ，氯霉素类耐药基因cmlA，喹诺酮类耐药基因qnrB携带率相对较低。HPI毒力岛基因irp1、irp2、fyuA携带率分别为40.91%、13.64%、13.64%。

3 讨论

大肠埃希菌可分为A、B1、B2和D共4个群，B2和D群是主要的肠道外致病大肠埃希菌[13-14]。李金朋等[15]研究显示，河南地区致病性大肠埃希菌分离菌多属于B2、D致病群；胡林等[16]对华东部分地区禽致病性大肠埃希菌进行研究发现，分离菌主要分布于A、B1群。本研究对四川地区分离的22株致病性大肠埃希菌进行分子分群及生物被膜形成能力分析，其中A群所占比例最大，B2群次之，与河南、华东地区的研究结果有所差异。大肠埃希菌生物被膜形成阳性率为72.73%，其中强成膜能力菌株占40.91%，总体阳性率所占比例较高，这一结果可能与分离株较强的耐药性有关，但具体关联还需进一步分析。

22株致病性大肠埃希菌对四环素类、喹诺酮类等抗生素耐药最普遍，对头孢类、丁胺卡那及多粘菌素B等抗生素较为敏感，其中有2株对除多粘菌素B之外的所有抗生素均耐药，其他菌株对19种抗生素均有不同程度的多重耐药性，此耐药情况与国内其他地区大肠埃希菌耐药情况相似[4，17-18]。

细菌产生耐药性的原因有很多，通常与细菌本身特性、耐药性基因的传播和药物的常规使用情况等因素有很大关系[19]。四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等抗生素药物是兽医临床常用药物，不合理添加及无限制地滥用使得大肠埃希菌耐药基因不断出现，且有越来越严重的发展趋势。

本试验从分离的22株猪源致病性大肠埃希菌中检测出12种不同类型的耐药基因型，其中四环素类耐药基因tetA、tetB的检出率均较高，表明这2种耐药基因在四川地区猪源致病性大肠埃希菌中普遍存在，与国内其他地区的研究结果相似[4，17]，且四环素类耐药基因tetA、tetB的检出率也与菌株对四环素类抗生素的耐药率相符合，这一定程度上也反映出了耐药基因型与耐药表型之间的相关性。磺胺类耐药基因sulⅠ、sulⅡ的检出率也相对较高，与菌株对磺胺类抗生素药物复方新诺明的高耐药率表型也相符合。根据寇宏等[20]、翟晶[21]的研究报道，贵州省、浙江省猪源大肠埃希菌sulⅠ、sulⅡ耐药基因的检出情况较为严重，表明我国磺胺类耐药基因携带率较高。氨基糖苷类耐药基因acc(3)-Ⅱ、aph(3’)-Ⅱ的耐药率分别为68.18%、50.00%，与河南地区的相关检测数据一致性很高[4]，低于陈琳等[22]对猪肠道中氨基糖苷类耐药基因acc(3)-Ⅱ、aph(3’)-Ⅱ的检出率。本试验中，猪源大肠埃希菌氯霉素类耐药基因floR的检出率最高，其次是cmlA，这一结果与坤清芳等[23]研究的四川地区兔源大肠埃希菌floR的检出率结果相差较大，表明即使在同一地区，不同来源的大肠埃希菌耐药基因的携带情况也有显著差异。喹诺酮类耐药基因qnrB检出率为40.91%，与闽西地区猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因qnrB检出率(37.8%)相似[24]，明显高于犬源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检出率[25]，这一现象可能是由于喹诺酮类抗生素药物广泛添加到食品动物生产养殖中。β-内酰胺类耐药基因TEM、SHV、OXA检出率较低，与河南地区猪源大肠埃希菌β-内酰胺类耐药基因的检出率差异较大[4]，河北地区鸡源大肠埃希菌β-内酰胺类耐药基因OXA携带率相似[26]。细菌耐受某种抗菌药物常常与其携带一种或多种耐药基因有关，所以耐药基因的检出率与其耐药表型之间存在一定的差异。四川地区猪源致病性大肠埃希菌的耐药基因型复杂，呈多重基因型共存。

相关研究表明，HPI毒力岛在我国养殖场大肠埃希菌分离株中普遍存在[27]。本试验中，HPI毒力岛基因irp1、irp2、fyuA检出率分别为40.91%、13.64%、13.64%，其中3株大肠埃希菌同时携带irp1、irp2、fyuA等3种HPI毒力岛基因及多种耐药基因。菌株同时携带多种毒力基因和耐药基因，可能使得其引发的疾病更加难以预防和治疗，对畜禽及人类造成的危害更加严重，应引起重视。