儿童产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究

陈泗虎 李 凯 张胜翔 李昌崇

肺炎克雷伯菌是一种阴性肠杆菌，是引起医院感染的重要阴性杆菌，随着广谱β-内酰胺和其他类型抗菌剂的广泛使用，多重耐药的肺炎克雷伯菌日益增多。多重耐药菌不仅给临床治疗带来很大难度，也给抗菌药物的研制和应用带来很大的挑战[1～3]。超广谱β-内酰胺酶是一种质粒介导的酶，可以水解青霉素，头孢菌素和单环内酰胺抗生素。因其用底物广泛而被称之为超广谱β-内酰胺酶，可通过质粒在不同种类的细菌之间传播[4～6]。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)种类繁多，目前，产超广谱β内酰胺酶的肺炎克雷伯菌在大多数国家和地区都有报道。由于使用抗生素的不同，不同国家或地区报道肺炎克雷伯菌感染的流行情况，不同医院产超广谱β内酰胺酶的肺炎克雷伯菌检出率也不同[7～9]。本研究分析了从笔者医院分离出的110株产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药性和耐药基因类型，为院内交叉感染的确定及临床实践中抗菌药物的合理应用提供理论依据，为进一步探索产超广谱β-内酰胺酶的耐药机制奠定基础。

材料与方法

1.菌株的来源：产超广谱β-内酰胺酶110株肺炎克雷伯杆菌从笔者医院2017年7月～2018年7月住院儿童患者的痰液、尿液、血液等各类标本分离得到，剔除同一患者同一部位重复分离菌株。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922，购自国家卫生健康委临床检验中心。

2.主要仪器及试剂：全自动微生物分析仪Walkaway 96SI西门子医疗系统集团；凝胶照相及图像分析系统购自上海复日科技公司；Bio-Rad power/PAC 3000型电泳仪购自北京六一仪器厂；药敏纸片与M-H琼脂培养基购自英国Oxoid公司；PCR反应体系、Taq酶、2kb PCR marker 2等购自宝生生物工程(大连)有限公司。

3.细菌的复苏及鉴定：将冷冻保存的菌株在室温下溶解，接种于血液板上，在35℃下培养18～24h，观察到菌落为较大、凸起、灰白色黏液型的菌落。细菌经革兰染色显微镜鉴定为G-球菌。全自动微生物鉴定仪Walkaway 96SI鉴定细菌。

4.超广谱β-内酰胺酶的确证：根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)1999年推荐的纸片扩散法对超广谱β-内酰胺酶的表型确证试验进行超广谱β-内酰胺酶的确认。根据纸片法的规定接种菌株于M-H平板上，贴各种抗生素纸片(头孢噻肟30μg、头孢噻肟/克拉维酸30μg/10μg、头孢他啶30μg、头孢他啶/克拉维酸30μg/10μg)，在35℃培养16～18h, 两种药物中任何一种，添加克拉维酸后的抑菌环直径均大于无克拉维酸的抑菌环直径，当抑菌环直径≥5mm时，可判定超广谱β-内酰胺酶。

5.药敏试验：抗菌药物敏感度试验对19种抗菌药物对产ESBLs肺炎克雷伯杆菌的MIC值采用2008年版《抗菌药物敏感性试验执行标准(CLSI)》所推荐的琼脂稀释法测定。K-B纸片扩散法确定， Whonet 5.4软件用于分析药敏资料，SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计处理，计数资料采用例(百分比)[n(%)]表示。

6.耐药基因的检测与分型：(1)基因组DNA的提取：将需测细菌菌株在LB肉汤培养基接种，在37℃下孵化20h，然后取1.5ml在12500r/min离心机上离心5min，弃上清，加去离子水500μl，95℃加热10min，12500r/min离心5min，上清液即为模板DNA，-20℃保存备用。(2)ESBLs耐药基因PCR扩增与分型:用特异性CTX-M-1、CTX-M-9、CTX-M-2、CTX-M-8、SHV、TEM型等6对引物对细菌进行DNA扩增。TEM型：引物1:5′-TCGGGGAAATGTGCG-3′；引物2：5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′。SHV型: 引物1：5′-TCGGCCTTCACTCAAGGAATG-3′；引物2：5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′。CTX-M-1组型：引物1：5′-CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG-3′；引物2：5′-GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC-3′。CTX-M-9组型：引物1：5′-GAGAGTGCAACGGATGATGT-3′； 引物2：5′-GATGATTCTCGCCGCTGAAG-3′。CTX-M-2组型：引物1：5′-CTCAGAGTATTCGCCGCTCA-3′； 引物2：5′-CCGCCGCAGCCAGAATATCC-3′。CTX-M-8组型：引物1：5′-ACTTCAGCCACACGGATTCA-3′； 引物2：5′-AAGTGGAGCGACAGAGC-3′。大连宝生物工程有限公司合成6对引物。PCR 体系含有200μmol/L dNTP,1×PCR缓冲液，10μl质粒DNA模板,2U Taq酶。PCR循环参数: 94℃ 5min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，共30个循环；72℃ 10min。取PCR产物10μl用1.0%琼脂糖凝电泳，电泳结果在紫外光下观察，使用SYNGENE凝胶图像分析系统进行处理分析。

结 果

1.产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌对19种抗生素的耐药性分析:产超广谱β-内酰胺酶菌株的耐药率详见表1。产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌表现为多重耐药性，对头孢唑啉、头孢唑啉、头孢噻嗪、头孢噻嗪等头孢菌素具有较高的耐药性，耐药率为77.2%～86.0%。酶抑制复合制剂的耐药率为31.8%～80.0%，对亚胺培南耐药率为0。

表1 产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌的耐药情况(n=110，%)

2.产ESBLs肺炎克雷伯杆菌PCR结果：用PCR方法检测了110株超广谱β-内酰胺酶阳性的肺炎克雷伯杆菌的基因型。分别以CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-8组、CTX-M-9组、TEM型、SHV型等6组引物对110株菌的耐药基因进行扩增，扩增呈阳性的DNA片断长度位置与对应的标准菌株产生的DNA片段位置一致，均与预期长度相符合(图1～图4)。在经表型确证实验明确为产超广谱β-内酰胺酶110株阳性菌的各耐药基因引物扩增中，引物扩增呈阳性株菌有88株，其PCR结果详见表2。产超广谱β-内酰胺酶110株肺炎克雷伯杆菌的基因型构成结果详见表3。

图1 TEM型引物PCR扩增结果M.marker；P.阳性模板；N.阴性对照； 1～5.阳性菌株

图2 CTX-M-9组型引物PCR扩增结果M.marker；P.阳性模板；N.阴性对照；1～5.阳性菌株

图3 CTX-M-1组型引物PCR扩增结果M.marker；P.阳性模板；N.阴性对照；1～6.阳性菌株

图4 SHV型引物PCR扩增结果M.marker；N.阴性对照；1～5.阳性菌株

表2 产ESBLs肺炎克雷伯杆菌菌株PCR结果

表3 产ESBLs肺炎克雷伯杆菌基因型构成

讨 论

超广谱β-内酰胺酶是一种质粒介导的酶，可以水解青霉素、头孢菌素和单环内酰胺抗生素。因其用底物广泛而被称之为超广谱β-内酰胺酶，可通过质粒在不同种类的细菌之间传播[4～6]。这些酶属于Bush-Jacoby-Medeiros最新分类法中的2be群[10]。目前ESBLs大部分由革兰阴性杆菌产生，其中主要以肺炎克雷伯杆菌产生为主。

自从1983年德国首次报道了产超广谱β-内酰胺酶菌株以来，在全世界各地都有广泛报道产超广谱β-内酰胺酶细菌的流行[11～14]。通过转导、转化以及接合等形式，细菌质粒介导的ESBLs能够转移或者获得相关的耐药基因。通过质粒在相同种属之间进行传递，可能造成院内感染大规模发生，目前产ESBLs菌株感染造成的暴发性流行报道有许多[15，16]。

本研究结果表明,产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌对青霉素类耐药率，哌拉西林为85.3%，而对第3代头孢菌素的耐药率头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟均为77.2%，均有较高的耐药性，这与卢彦等[17]报道基本相符，这说明他们是ESBLs适宜的水解底物，提示产ESBLs肺炎克雷伯菌感染的治疗难度很大。对左氧氟沙星耐药率为30.0%，环丙沙星耐药率为34.5%，低于国内其他地区报道[18]。考虑可能与本研究的菌株来自于儿童医院的患者，而儿童是慎用喹诺酮类抗生素的，导致抗生素的选择压力较小而引起耐药性相对较低有关。哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦等酶抑制复合制剂的耐药率分别为31.8%、80.0%。相对于其他地区本结果中产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌对青霉素类、头孢菌素类抗生素有较高的耐药率，原因可能与儿童感染患者广泛应用β-内酰胺类抗生素有关。对亚胺培南等碳青霉烯类耐药率为0，保持高度敏感度。关于产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌感染患儿的治疗，病情轻者根据药敏结果可酌情应用酶抑制复合制剂类抗生素，对于重症感染的治疗应以碳青霉烯类抗生素作为首选，同时需结合患者的具体情况开展个体化治疗。

目前，已发现接近700种质粒介导ESBLs的基因型，其中以TEM、 SHV、OXA、 CTX-M等基因型居多[19]。Castanheira等[20]报道，美国感染ESBLs细菌的基因型以SHV-12和TEM-1型为主。林海波等[21]报道的中国台湾地区以CTX-M-3型和SHV-12型为主。高伟等报道安徽地区ESBLs细菌的基因型以CTX-M-22型、CTX-M-14型为主。本研究结果中，在经表型确证实验明确为产超广谱β-内酰胺酶110株阳性菌的各耐药基因引物扩增中，引物扩增呈阳性株菌有88株。TEM型占41.8%，SHV型占4.5%，CTX-M-1型占42.7%，CTX-M-9型占32.7%。不同国家及国内不同地区流行的ESBLs病原菌基因型存在差异，考虑主要与各地区患儿所使用的抗菌药物的种类、剂量等不同有关。另外本研究结果中检出两种或两种以上的耐药基因型共同存在的菌株有41株(37.3%),主要为CTX-M-1型与CTX-M-9型或TEM型共同存在，这一现象说明产ESBLs肺炎克雷伯杆菌可同时携带两种或两种以上广谱酶。另外有22株6对引物扩增均为阴性，但其耐药表型为超广谱β内酰胺酶，故其耐药基因型有待于进一步研究。

综上所述，产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌感染已成为儿童临床感染性疾病治疗的难题。儿科医生在临床工作中，要结合药敏结果，合理应用抗生素，特别是第3代头孢菌素，延缓耐药菌株的产生，要轮换使用抗生素等，对控制产ESBLs菌株医院感染将起到十分重要的作用。