不同抗生素耐药水平下幽门螺杆菌对黄连素的耐药特性

陈 霞 夏晨梅 张忠臣 钱小棋 王雨银 毛珺梁 汤清清

幽门螺杆菌(H.pylori)被认为是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等多种疾病的主要病因，且根除H.pylori可显著改善胃黏膜炎性反应，促进溃疡愈合，降低胃癌发生率[1, 2]。菌株对抗生素产生耐药是导致H.pylori根除失败的主要原因[3]。但是，随着抗生素的广泛应用，尤其是抗生素的不规范使用以及滥用，致使H.pylori对抗生素耐药问题日益严重。近年来我国H.pylori对克拉霉素、左氧氟沙星及甲硝唑耐药率呈上升趋势，且H.pylori菌株对多种抗生素同时耐药也越来越多，导致H.pylori根除率逐年下降[4]。因此，许多研究人员在不断寻求理想的根治H.pylori方案。

众所周知，大量抗生素的使用会破坏人体正常的肠道菌群，出现一系列不良反应。相对来说，中药毒性不良反应小，且部分中药提取物具有抗菌作用，对H.pylori具有抑制和杀灭作用[5, 6]。有研究表明，黄连素用于三联、四联方案有利于提高H.pylori根除率，还有不良反应少、价格低廉、患者耐受性好等特点[7～9]。目前黄连素用于H.pylori根除治疗的临床研究开展得较多，但体外黄连素对H.pylori的药物敏感试验研究较少，本研究以台州市温岭地区H.pylori菌株为研究对象，调查该地区H.pylori菌株对黄连素的耐药率，为H.pylori根除治疗的临床用药做指导。

材料与方法

1.研究对象：选取因胃部疾病至温岭市第一人民医院就诊的胃镜检查患者，于胃镜下采集胃黏膜标本1份，置于组织保存管中，低温运输送检。该研究已通过温岭市第一人民医院伦理学委员会审核。病例入选标准：①年龄30～55岁，男女不限；②呼气试验结果为H.pylori阳性；③近2周内未使用抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂或 PPI 制剂。病例排除标准：①严重心、肝、肾功能损害者；②妊娠或哺乳期女性；③有食管、胃肠手术史者；④患者不能正确表达自己的主诉，如精神病、严重神经官能症者；⑤患者同时服用非甾体抗炎药或酗酒。

2.幽门螺杆菌分离培养：胃黏膜标本经过研磨后接种于含5%羊血的哥伦比亚培养基，37℃ 微需氧培养(5%O2、10%CO2、85%N2)2～3 天，观察菌落的生长情况，经生化反应(尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶)试验和镜检鉴定，确定为H.pylori菌株后保存菌株。

3.抗生素平板配制：药物敏感度试验的抗生素包括甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素及黄连素。抗生素标准品均购自中国食品药品检定研究院。在平板上进行相应抗生素标记，每个平板中添加 2ml 抗生素稀释液，并用移液管准确量取 18ml MH 培养基(已加入5%羊血)，混匀后正置待凝固。4℃倒置保存。平板中抗生素终浓度梯度分别为(μg/ml)：①甲硝唑：64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25；②克拉霉素：4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156；③左氧氟沙星：8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312；④阿莫西林：4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156；⑤四环素：4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156；⑥黄连素：64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125。其中，克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素、甲硝唑的耐药临界点分别为 1、2、2、2、8μg/ml, 黄连素的耐药临界点目前临床上还未有明确规定。

4.药物敏感度试验：对保存的菌株统一进行药物敏感度试验。将复苏且传代生长较好的H.pylori菌株分别收集于0.9%氯化钠溶液中，配制成吸光度2～3麦氏的菌悬液，滴加于抗生素平板上，每滴 2～3μl，每个平板滴数在 15～25 滴之间。建立平行 1 组，空白对照 1 组。于37℃、5%O2、10%CO2的条件下培养2～3 天。判读药敏试验结果。根据H.pylori生长及受抑制情况记录每个梯度生长的H.pylori菌株。

结 果

1.患者基本信息：本实验共分离获得H.pylori菌株 84 例。入选患者年龄31～55 岁，平均年龄为43.06 岁，男女性别比例为1∶2。男女性别、年龄间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.抗生素对H.pylori菌株的MIC值：阿莫西林及四环素对84例H.pylori菌株的最低抑制浓度(MIC)均小于0.0625μg/ml。其余 4 种抗生素对 84 例H.pylori菌株的 MIC 范围为甲硝唑0.5～32μg/ml，克拉霉素0.125～2μg/ml，左氧氟沙星0.0625～4μg/ml，黄连素4～32μg/ml。图1为各梯度含量下不同MIC值的菌株个数统计。由图1可知，对于克拉霉素及左氧氟沙星，菌株个数在临界MIC值达到高峰，在抗生素下一个梯度含量时所有菌株都被抑制生长或杀灭。而甲硝唑及黄连素，随着MIC值增加，菌株个数也增加。甲硝唑在临界点MIC值前，菌株个数不多，达到临界点后开始呈上升趋势。

图1 不同MIC值的菌株个数

3.黄连素与其他抗生素耐药相关性：黄连素与甲硝唑耐药存在显著相关性(r=0.403，P=0.008)，由图1可知，随着 MIC 值升高，对甲硝唑及黄连素敏感的菌株个数走势基本一致。与克拉霉素及左氧氟沙星耐药无相关性(克拉霉素：r=0.181，P=0.251；左氧氟沙星：r=0.248，P=0.113)。

4.H.pylori菌株耐药率及性别间差异：84 例H.pylori菌株对阿莫西林及四环素均敏感，对克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑的耐药率分别为16.67%、16.67%、54.76%。克拉霉素+左氧氟沙星、左氧氟沙星+甲硝唑、克拉霉素+甲硝唑两种抗生素耐药的耐药率分别为2.38%、9.52%、11.90%。克拉霉素+左氧氟沙星+甲硝唑 3 种抗生素都耐药的耐药率为2.38%。H.pylori菌株对各抗生素的耐药率在男、女性别差异如表1所示，本研究结果显示，H.pylori菌株对部分抗生素的耐药作用与性别无关。

表1 各抗生素耐药率及性别间的差异

5.H.pylori菌株对黄连素耐药率分布与性别的关系：由于黄连素没有明确的临界点 MIC 值，本研究将菌株按性别分为两组，分别将 4、8、16、32μg/ml 设为耐药临界点，对H.pylori菌株的黄连素耐药率在男、女性别间进行比较。数据见图2，H.pylori菌株对黄连素的耐药率在男、女性别间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 H.pylori菌株对黄连素耐药率分布与性别的关系

6.黄连素 MIC 值与不同抗生素耐药组合的相关性：本研究对H.pylori菌株按照全敏感、单种抗生素耐药、2 种抗生素耐药和3 种抗生素耐药分成 4 组，比较黄连素对这 4 组菌株 MIC 值的平均值，详见表 2。结果显示，随着菌株对其他抗生素耐药性增强，其对黄连素的耐药性有增强趋势。其中，黄连素对全敏感菌株的 MIC 和其他3组即对单耐药、双耐药及 3 种抗生素耐药菌株的MIC比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 黄连素MIC值与不同抗生素耐药组合的相关性

讨 论

本研究中H.pylori菌株对克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑的耐药率分别为16.67%、16.67%、54.76%。克拉霉素与左氧氟沙星的耐药率略低于浙江省平均水平(克拉霉素 16.67% vs 17.9%；左氧氟沙星 16.67% vs 23.13%)，但甲硝唑耐药率显著低于浙江省平均耐药水平(54.76% vs 95.44%,P<0.05)，这可能与温岭地区经济发展较快、生活水平普遍较高有关，人们选择使用其他非广谱抗生素代替甲硝唑[10～12]。因此，甲硝唑耐药水平较低。

研究表明，许多中药如黄连、大黄、黄芩、板蓝根等对H.pylori具有抑制和杀灭的作用[13～16]。黄连素作为黄连的主要成分，可以破坏H.pylori菌株荚膜、降低分泌多糖能力，抑制H.pylori形成生物膜，从而达到抑制和杀灭H.pylori的效果[17]。本研究显示，黄连素在较低浓度下(4 μg/ml)对H.pylori菌株就具有抑制或杀灭的作用，与杨行堂等[18]研究结果一致。同时，甲硝唑在临界点 MIC 值前，菌株个数不多，达到临界点后开始呈上升趋势。甲硝唑在治疗给药过程中也是呈剂量依赖性的，加大甲硝唑的剂量，能提高H.pylori根除率[19]。黄连素与甲硝唑耐药呈正相关，由图 2 可知，随着黄连素梯度含量增加，菌株耐药率越来越低，即黄连素的抗菌作用越来越强，与杨行堂等[18]研究结果也一致。此研究结果为临床上运用黄连素对H.pylori进行根除治疗的用药方案提供了有利依据。

本研究判定黄连素 MIC 值范围为4～32μg/ml。吴静等[20]用试管 2 倍稀释法体外测定黄连素对H.pylori的 MIC 值为 0.025g/ml。吴明慧等[5]用试管 2 倍稀释法测定黄连素对H.pylori多重耐药菌株的MIC值为 12.5mg/ml。二者结果不一致。可能原因为：①菌株本身的耐药性具有差异，本研究结果显示，H.pylori菌株对黄连素的耐药性与对甲硝唑的耐药性呈正相关，而本研究菌株对甲硝唑的耐药性是显著低于浙江省耐药水平的；②菌株的来源具有较大差异，不同地区由于地理气候等条件不同，抗生素使用情况不同，菌株对抗生素的耐药性也不同，本研究菌株仅来源于台州温岭地区。

此前有研究表明H.pylori菌株对部分抗生素的耐药作用与性别有关[9, 10]。但本研究显示H.pylori菌株对抗生素耐药作用与性别之间无相关性，同时本研究得出黄连素各梯度含量下对H.pylori菌株的耐药率在性别间比较差异无统计学意义(P>0.05)。这是否跟菌株数量、菌株来源及菌株耐药性等相关，需进一步实验研究加以证实。

本研究根据菌株对不同抗生素的耐药性将菌株分为4组，分析黄连素对这4组菌株 MIC 值的平均值，结果得出随着菌株对其他抗生素耐药性增强，其对黄连素的耐药性有增强趋势。其中，黄连素对全敏感菌株的 MIC 和对单耐药、双耐药及3种抗生素耐药菌株的MIC比较差异有统计学意义。本研究选取的H.pylori菌株从对抗生素敏感到耐药各个阶段均有分布，且所有菌株对阿莫西林及四环素都是敏感的，而吴明慧等研究的H.pylori菌株均为多重耐药菌株，包括对阿莫西林等抗生素耐药，因此吴明慧等研究黄连素对多重耐药菌株的 MIC 值也相对较高[5]。这也可以解释本研究黄连素对H.pylori菌株 MIC 值范围为 4～32μg/ml，远小于吴明慧等[5]得出的黄连素对多重耐药菌株的 MIC 值 12.5mg/ml。

随着H.pylori对抗生素耐药问题日益严重，H.pylori根除率正逐年下降，研究人员迫切需要寻求新的、更为理想的根治H.pylori方案。本研究结果表明，黄连素在较低浓度下对H.pylori具有一定的抑制或杀灭的作用，且随着黄连素梯度含量增加，抗菌效果增加，可作为治疗方案的一种选择。本研究结果为中药参与到H.pylori根除治疗打开了新思路，为制订黄连素参与的H.pylori治疗方案提供了科学依据。