线粒体自噬在糖尿病因素影响七氟醚后处理心肌保护作用中的机制

郭大鹏 贺建东 韩冲芳 王一珍 王志豪 王 慧

缺血性心血管疾病已成为威胁人类健康的重要杀手，目前主要的治疗措施是恢复缺血心肌的有效灌注。然而缺血心肌在恢复血液灌注后其缺血性损伤可能进一步加重，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。而七氟醚作为临床中常用的吸入麻醉药，被证实具有减轻非糖尿病大鼠MIRI的保护作用[2]。线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程，维持适度的线粒体自噬水平对细胞内线粒体稳态及正常生理功能具有重要作用[3]。研究发现，七氟醚后处理减轻大鼠MIRI的机制与线粒体自噬关系密切[4]。糖尿病作为心血管疾病的独立危险因素，严重威胁着人类的生命健康，并且糖尿病患者发生MIRI较非糖尿病患者更为严重[5]。研究发现，糖尿病因素可降低或取消七氟醚后处理的心肌保护作用，其机制尚有待于深入研究[6,7]。本研究拟通过建立糖尿病模型和心肌缺血再灌注模型，从线粒体自噬角度探讨糖尿病因素影响七氟醚后处理心肌保护作用的机制。

材料与方法

1.动物的选择及分组：清洁级健康雄性SD大鼠32只，7～8周龄，体质量250～300g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。动物饲养和实验操作均符合山西医科大学动物伦理学委员会相关规定，适应性观察1周。以是否糖尿病与是否给予七氟醚后处理进行两因素(2×2)析因设计，采用数字表法随机分为4组(n=8),即非糖尿病缺血再灌注组(NI/R组)、非糖尿病七氟醚后处理组(NSP组)、糖尿病缺血再灌注组(DMI/R组)和糖尿病七氟醚后处理组(DMSP组)。

2.糖尿病大鼠模型的建立：参照参考文献[8]的方法制备大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖饲料适应性喂养4周后，禁食不禁饮8h，腹腔注射链脲佐菌素(STZ，批号：S1030，美国Sigma公司)30mg/kg，72h后尾静脉采血，测定空腹血糖。以血糖≥16.7mmol/L，并出现多饮、多食、多尿症状为模型制备成功。

3.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立：参照参考文献[2]介绍的方法，采用结扎左冠状动脉前降支血流30min再灌注120min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。SD大鼠术前禁食8h，不禁饮。经1%戊巴比妥钠(75mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰卧位固定，连接肢体导联心电图电极，接BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)监测标准Ⅱ导联心电图。颈部正中切开，于气管插管成功后连接ALC-V8型动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)行机械通气，潮气量8ml/kg，通气频率60次/分，吸呼比1∶2，呼吸机进气口连接七氟醚挥发罐(德国Draeger公司)，呼吸机出气口连接Vamos麻醉气体监测仪(德国Draeger公司)，吸入氧浓度33%(氧流量3L/min)。于左侧第4、5肋间开胸，剪开心包膜，暴露心脏及左心耳。以8-0带线缝合针于动脉圆锥靠近左心耳下缘水平处(冠状动脉左前降支根部1～2mm)进针穿线；穿线后将丝线两头穿过硅胶管，平衡15min后用血管钳向前收紧硅胶管造成左冠状动脉前降支缺血，以心电图示ST段抬高、T波高耸、心肌组织颜色逐渐变暗为缺血成功标志。缺血30min时松开结扎线恢复灌注，以心电图示ST段明显下降，心肌缺血区恢复红润为再灌注成功的标志。其中NSP组和DMSP组于再灌注前1min吸入七氟醚(批号：18101931，上海恒瑞医药有限公司)，维持呼气末浓度2.5%，持续5min。

4.血清cTnI浓度测定：于再灌注120min时，经颈动脉采血3ml，4℃冰箱静置30min后，以3500r/min离心10min，离心半径15cm，取血清置于-20℃冰箱保存。采用ELISA法检测cTnI浓度，试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。

5.TTC法测定心肌梗死面积：于再灌注120min时，再次收紧套管阻断冠脉血流，颈静脉注射1%伊文蓝染液2ml后处死大鼠，快速取出心脏，于-20℃冰箱放置2h，用心脏切割器沿心脏长轴方向将其切成厚度约为2mm的薄片，行TTC染色，恒温水浴锅孵育15min，PBS缓冲液3次后10%甲醛固定24h。拍照后采用Image ProPlus5.0软件进行分析，测定梗死区面积(即灰白色区域)与存活区面积(即砖红色区域)，计算心肌梗死面积=梗死区面积/存活区面积。

6.心肌超微结构透射电镜下观察：于再灌注结束时处死大鼠并取心肌组织，切取约1mm3左心室组织置于2.5%戊二醛固定液(0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH值7.4)中，4℃固定2h，经0.1mol/L 磷酸缓冲液漂洗后，用1%锇酸固定液(0.1mol/L 磷酸缓冲液配制，pH值7.4)，4℃固定2h，组织块经递增浓度的乙醇脱水后用Spurr 树脂浸透包埋，70℃聚合8h，超薄切片机切片，切片经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，采用JEM-1011型透射电子显微镜观察左心室心肌细胞超微结构及线粒体自噬的情况。

7.Western blot法检测心肌线粒体自噬蛋白表达：取心尖组织，使用4℃预冷的PBS清洗组织两次，去除组织中残留血液；研磨、裂解提取组织蛋白，使用BCA蛋白质检测试剂(批号：23225，美国Thermo Scientific公司)采用BCA法进行蛋白质浓度的测定。蛋白样品上样30μg，电泳分离蛋白样品，转移至PVED膜，室温封闭2h，然后加入一抗LC3(1∶800，美国Cell Signaling公司)、p62(1∶1000，美国Cell Signaling公司)和Parkin(1∶800，美国Abcam公司)，4℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次后二抗GAPDH室温孵育2h，TBST再洗涤3次，使用ECL试剂盒(批号：1705060, 美国BIO-RAD公司)避光反应3～5min，化学光敏模式曝光显影，采用Image J图像分析软件测定条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平差异。

结 果

1.心肌组织超微结构改变：电子显微镜下，NI/R组线粒体大小不均，排列紊乱，线粒体嵴出现断裂，基质紊乱，线粒体出现肿胀，可见线粒体自噬体，心肌细胞损伤严重；与NI/R组比较，NSP组线粒体结构较完整，线粒体轻度肿胀，损伤较轻；而与NI/R组比较，DMI/R组和DMSP组线粒体损伤明显加重，排列极紊乱，线粒体嵴出现断裂，基质紊乱，线粒体肿胀更加明显，空泡化、片段化变形严重，心肌细胞损伤更严重，详见图1。

图1 4组大鼠心肌组织电镜结果(透射电镜，×20000)

2.析因方差结果：非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠发生心肌缺血再灌注时血清cTnI浓度比较差异有统计学意义(F=105.908，P<0.05)，非七氟醚后处理组与七氟醚后处理组血清cTnI浓度比较差异有统计学意义(F=35.755，P<0.05)，糖尿病大鼠与七氟醚后处理二者在血清cTnI浓度存在交互效应(F=4.716，P<0.05)。非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠心肌梗死面积比较差异有统计学意义(F=237.070，P<0.05)，非七氟醚后处理组与七氟醚后处理组心肌梗死面积比较差异有统计学意义(F=21.291，P<0.05)，糖尿病大鼠与七氟醚后处理二者对心肌梗死面积存在交互效应(F=3.191，P<0.05)。非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠LC3比值比较差异有统计学意义(F=461.409，P<0.05)，非七氟醚后处理组与七氟醚后处理组LC3比值比较差异有统计学意义(F=9.860，P<0.05)，糖尿病大鼠与七氟醚后处理两因素在LC3比值上存在交互效应(F=30.195，P<0.05)。非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠p62含量比较差异有统计学意义(F=173.962，P<0.05)，非七氟醚后处理组与七氟醚后处理组p62含量比较差异有统计学意义(F=8.281，P<0.05)，糖尿病大鼠与七氟醚后处理二者在p62含量上存在交互效应(F=54.083，P<0.05)。非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠Parkin含量比较差异有统计学意义(F=144.244，P<0.05)，非七氟醚后处理组与七氟醚后处理组Parkin含量比较差异有统计学意义(F=10.919，P<0.05)，糖尿病大鼠与七氟醚后处理二者在Parkin含量存在交互效应(F=25.844，P<0.05，表1，图2)。

表1 析因试验结果的方差分析表

图2 析因试验结果的交互作用图A.cTnI;B.心机梗死；C.LC3;D.p62;E.Parkin

3.4组大鼠各指标的比较：与NI/R组比较，NSP组血清cTnI浓度降低，心肌梗死面积减少，心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表达下调，p62的表达上调(P<0.05)。与NI/R组比较，DMI/R组血清cTnI浓度升高，心肌梗死面积增加，心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表达下调，p62的表达上调(P<0.05)。与NSP组比较，DMSP组血清cTnI浓度升高，心肌梗死面积增加，心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Parkin的表达下调，p62的表达上调(P<0.05)。与DMI/R组比较，DMSP组血清cTnI浓度、心肌梗死面积、心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Parkin和p62的表达差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表2 4组大鼠血清cTnI、心肌梗死面积及各蛋白表达比较

讨 论

本研究参照参考文献[8]的方法，以高脂高糖饲养和腹腔小剂量注射链脲佐菌素的方法制备大鼠2型糖尿病模型，并以给药后72h的空腹血糖≥16.7mmol/L，出现多饮多食多尿症状为糖尿病模型制备成功。参照参考文献[2]介绍的方法，采用结扎左冠状动脉前降支血流30min再灌注120min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，心电图中ST段与T波的阳性表现及心肌病理学损伤加重，表明大鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备成功。

线粒体是真核生物进行能量代谢的重要场所，并且参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程[9,10]。通过线粒体自噬清除受损或不需要的线粒体，对于维持线粒体的稳态及细胞生存具有重要意义。线粒体自噬的调控有多条信号通路的参与，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是目前哺乳动物细胞中研究较深入的信号通路。PINK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要存在于线粒体外膜。Parkin是一种E3泛素酶，主要存在于细胞质中。线粒体功能正常时，PINK1通过线粒体膜上的转位酶转移到线粒体内膜降解。当线粒体受损时，PINK1转运受阻，聚集于线粒体外膜。PINK1在线粒体外膜的积聚将诱导具有E3泛素连接酶活性的Parkin由胞质移位到损伤的线粒体，使线粒体外膜的特异性底物蛋白泛素化并募集p62蛋白，进而与自噬蛋白LC3结合，胞质型LC3(即LC3Ⅰ)被脂质化为膜型LC3(即LC3Ⅱ)，介导泛素化的底物进入自噬体，启动线粒体自噬以清除受损线粒体[11,12]。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低[13]。P62在细胞质中与LC3Ⅱ形成复合物，发生自噬时被溶酶体降解，表达水平降低，与自噬水平呈负相关[14]。析因试验结果的方差分析显示，七氟醚后处理在大鼠血清cTnI浓度、心肌梗死面积、心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Parkin的表达都存在主效应，通过七氟醚后处理，大鼠血清cTnI浓度降低，心肌梗死面积减少，心肌自噬蛋白LC3、Parkin表达减少，p62表达增多，提示线粒体自噬水平降低，心肌缺血再灌注损伤减轻，七氟醚后处理的心肌保护作用可能与抑制过度激活的线粒体自噬有关。

糖尿病心血管系统损伤是糖尿病患者的主要并发症之一[15]。本研究结果显示，糖尿病因素在大鼠血清cTnI浓度、心肌梗死面积、心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Parkin的表达上具有主效应，糖尿病大鼠组的血清cTnI浓度升高，心肌梗死面积增加，心肌自噬蛋白LC3、Parkin表达减少，p62表达增多，心肌缺血再灌注损伤加重，但心肌线粒体自噬水平降低，提示糖尿病因素可能导致心肌细胞线粒体自噬过程受阻，心肌细胞未能及时清除缺血再灌注过程中受损或功能障碍的线粒体，进而增加活性氧的释放，加重心肌缺血再灌注损伤。适度的线粒体自噬水平对于维持心脏的正常生理功能具有重要作用，自噬过程受阻会导致受损伤的线粒体未能及时清除进而加重心肌损害；线粒体自噬过度又会导致线粒体减少供能不足。七氟醚后处理减轻非糖尿病大鼠的缺血再灌注损伤，但对于糖尿病大鼠心肌保护作用失效，其机制可能与糖尿病大鼠线粒体自噬水平降低有关。鉴于本研究为在体实验，无法排除神经体液因素的影响，因此有待于开展离体实验研究进一步证实。

综上所述，七氟醚后处理对糖尿病大鼠的心肌保护作用减弱，其机制可能与糖尿病大鼠的心肌线粒体自噬水平降低有关。