亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶遗传多态性与傣族高同型半胱氨酸血症的相关性研究

番云华 徐龙江 易薇 王冠 王勋 杨必清 葛世军 孙浩 黄小琴 褚嘉祐 杨昭庆(通信作者)

678400云南省德宏州人民医院检验科1，云南德宏

650118中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所医学遗传学研究室2，北京

同型半胱氨酸又称为高半胱氨酸(Hcy)，是人体内半胱氨酸与甲硫氨酸代谢过程中生成的中间产物。根据血同型半胱氨酸临床诊断标准，人体正常情况下血浆同型半胱氨酸浓度为5～15 μmol/L，浓度高于15 μmol/L 可诊断为高同型半胱氨酸血症(HHcy)。近年的研究表明，Hcy 是脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要危险因子[1]。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢和同型半胱氨酸代谢的关键酶，酶活性的改变能够影响血液中同型半胱氨酸的水平。MTHFR C677T 错义突变使密码子编码氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，可导致MTHFR 酶的热稳定性和活性下降，导致血浆中Hcy 水平升高[2-4]。遗传、环境是影响Hcy 水平的主要因素。目前国内尚无傣族人群中MTHFR A1298C(rs1801131)、 C677T(rs1801133)、MTRR A66G(rs1801394)基因多态性与HHcy的相关性研究。本研究通过对来自云南省德宏州人民医院的438 例傣族样本作为研究对象，探讨傣族人群中亚甲基四氢叶酸还原酶 MTHFR A1298C(rs1801131)、 C677T(rs1801133)、甲硫氨酸合成还原酶MTRR A66G(rs1801394)基因多态性与HHcy的关联，现报告如下。

资料与方法

选择2016年在云南省德宏州人民医院就诊体检样本438 例，排除吸烟、妊娠人群，且未患有肾功能障碍、恶性肿瘤、尿毒症、甲状腺功能低下等影响Hcy 的疾病；其中男192 例，女246 例；平均年龄(65.82±13.29)岁；血浆Hcy＞15 μmol/L 即诊断为高同型半胱氨酸血症；根据Hcy 水平将研究样本分为HHcy组150 例和对照组288例，所有入选者均为本地区世居的傣族居民；取血检查前未补充叶酸及B族维生素，未服用影响Hcy水平的药物，如马西平、异烟肼等[5-6]。

DNA 提取及Hcy、叶酸测定：所有研究对象均空腹采集外周静脉血5 mL，2 h内离心分离，采用酶循环法检测血浆Hcy 水平，电化学发光法测定血浆中叶酸浓度。

SNP 位点的基因型检测：实时荧光定量PCR 法进行SNP 分型，用于检测MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C(rs1801131)、 MTRR A66G(rs1801394)3 个SNP 位 点 的 预 制TaqMan 探针及引物预混液由Applied Biosystems 公司(美国)设计合成，针对单个SNP 位点设计的两条探针分别用FAM和VIC 荧光基团进行标记。TaqMan 法对rs1801133、rs1801131、rs1801394 位 点进行基因分型，采用罗氏LightCycler480高通量实时荧光定量PCR 系统检测SNP位点，并用配套软件(LCS4801.5.1.62)进行数据处理得到基因分型。采用二代测序技术对 rs1801133、 rs1801131、rs1801394 位点的基因分型结果进行测序验证。

结 果

Hardy-Weinberg 遗传平衡检验：根据Hardy-Weinberg 定律，在本研究所选取的样本中MTHFR C677T(χ2=0.0208，P=0.8855)、 MTHFR A1298C( χ 2=0.3477，P=0.5554)、MTRR A66G(χ 2=1.6572，P=0.1979)，基因频率符合Hardy-Weinberg平衡，具有较好的群体代表性。同时HHcy组与对照组性别比例和年龄分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

两组3 个SNP 位点的基因分型比较：采用二代测序技术对rs1801133、rs1801131、rs1801394位点的基因分型结果进行测序验证，对照组与HHcy 组MTHFR C677T(rs1801133)、 MTHFR A1298C(rs1801131)、 MTRR A66G3(rs1801394)SNP位点的等位基因和基因型频率分布比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 两组3个SNP位点的基因频率及等位基因频率分布[n(%)]

两组 MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C(rs1801131)多态性位点的连锁平衡分析：用SHEsis 软件对MTHFR C677T(rs1801133)、 MTHFR A1298C(rs1801131)2个多态性位点进行连锁不平衡分析，rs1801133(C＞T) 和rs1801131(A＞C)之间D'值为0.882，r2 值为 0.073，显示 rs1801133(C＞T) 和rs1801131(A＞C)位点之间存在强连锁不平衡。

MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C(rs1801131)、 MTRR A66G(rs1801394)多态性与血液中Hcy、叶酸水平关联性分析：rs1801131 位点AA、AC和CC 3种基因型的样本中HHcy所占比例、Hcy 和叶酸水平差异无统计学意义(P＞0.05)；rs1801133 位 点CC、CT、TT 基因型HHcy 所占比例、Hcy 水平差异无统计学意义(P＞0.05)。进一步行同一SNP 位点不同基因型间叶酸和Hcy 水平的两两比较显示：rs1801133 位点的CT 基因型与CC、TT 基因型的血浆中叶酸水平差异有统计学意义(P＜0.05)；CT 基因型的血浆中叶酸水平低于CC、TT 基因型；rs1801394 位点的AA 基因型与AG、GG基因型的血浆中Hcy水平和叶酸水平差异有统计学意义(P＜0.05)；AA基因型的血浆中的Hcy水平和叶酸水平均低于AG、GG基因型。见表2。

表2 两组各SNP基因型血浆Hcy和叶酸水平及HHcy比例比较

讨 论

近年来相关研究表明，血浆同型半胱氨酸水平相关遗传因素MTHFR 和MTRR 的基因多态性在各民族和地域的人群中存在群体差异性，然而在我国具体地区和民族中的遗传分布仍不十分清楚，使由于同型半胱氨酸水平异常而引起的相关疾病预防工作遇到阻碍。本研究结果显示，在云南德宏傣族群体中rs1801133、rs1801131、rs1801394 位 点基因多态性与高同型半胱氨酸血症无相关性。然而rs1801133 和rs1801394 位点呈现QTL 阳性结果，rs1801133 位点CT基因型与CC、TT基因型比较，血浆中叶酸水平差异有统计学意义(P＜0.05)，CT基因型的血浆叶酸水平低于CC、TT基因型；rs1801394 位点AA 基因型与AG、GG基因型比较，血浆Hcy水平与叶酸水平差异有统计学意义(P＜0.05)，AA 基因型血浆中Hcy与叶酸水平均低于AG、GG基因型。

近年来，有大量队列研究表明，MTHFR C677T 位点突变可能是高同型半胱氨酸血症的危险因素，Kang等对HHcy和MTHFR 基因突变的相关性研究表明MTHFR 基因具有多态性[7]，其中MTHFR C677T 突变最为常见，该突变降低亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和热稳定性，继而影响体内叶酸代谢，使Hcy 甲基化过程受阻导致同型半胱氨酸在血浆中水平升高。本次研究中，rs1801133 位点CC、CT、TT 三种基因型分布频率以及C、T 等位基因频率在HHcy 组与对照组中的差异不具有显著性。与以往相关研究得出的TT 纯合子型患者的Hcy 水平明显高于同组的CC 纯合子型患者的结论不一致[8]。同时CC、CT、TT三种基因型的叶酸水平具有显著性差异，表明MTHFR C677T 突变可能与MTHFR 酶活性差异有关。

关于MTHFR 基因A1298C 位点的大量群体性调查研究显示，该位点的突变分布在不同种族和地区具有差异性，CC突变纯合子在高加索人群中的频率为10%。而在东亚地区如中国、日本和韩国人群中一般低于5%[9]。一项纳入15 357例样本的流行病学调查研究显示，在我国汉族群体中A1298C的分布具有地理差异，C 等位基因和CC 基因型频率基本呈现从北到南逐渐升高的趋势，C 等位基因频率和CC基因型频率平均水平分别为18.6%和3.9%[10]。本研究样本对象中，C等位基因频率和CC 基因型频率分别为28.88%和7.76%，显著高于北方省份如山东省13.1%和1.4%，山西省14.8%和2.2%，河南省14.2%和2.5%。同时我们发现傣族人群中rs1801131 位点AA、AC、CC基因型携带者Hcy水平无明显差异，与Zappacosta等在意大利中南部人群调查得到的结果一致[11]。

MTRR 基因A66G 多态性具有群体差异，为HHcy的重要易感因素。MTRR 是维持依赖与维生素B12的蛋氨酸合酶活性状态的黄素蛋白，该酶涉及蛋氨酸合酶、同型半胱氨酸的甲基化代谢，MTRR 66A→G 导致异亮氨酸改变为蛋氨酸，可导致体内同型半胱氨酸的蓄积。AA 基因型可中度升高同型半胱氨酸水平；与GG 纯合子相比，携带AA 基因型的人群患心血管疾病的可能性升高4%。本研究认为，rs1801394 位点AA、AG、GG 基因型的Hcy 和叶酸的水平差异有显著性，表明MTRR A66G 突变可能导致MTRR 酶活性下降，影响Hcy 及叶酸的代谢，造成血浆中Hcy 和叶酸水平的差异[12]。

鉴于Hcy 是心脑血管疾病的一个重要风险因素，通过对Hcy 代谢过程中关键SNP 位 点MTHFR A1298C(rs1801131)、MTHFR C677T(rs1801133)、 MTRR A66G(rs1801394)基因多态性与HHcy表型关联性研究，有助于指导临床医生了解不同基因型患者罹患高同型半胱氨酸血症的风险，从而采取个体化的处方策略，及时调控患者血浆Hcy 水平，降低多种心脑血管疾病譬如脑卒中和动脉粥样硬化的发病风险，预防血浆中高水平的同型半胱氨酸所引起的相关疾病的发生发展。由于高同型半胱氨酸血症的发生是遗传和环境多种因素相互作用的复杂过程，MTHFR 和MTRR 基因的表达可能受到转录、翻译过程中的修饰以及蛋白质之间的相互作用影响，从而导致本研究得到的结论与其他相关研究结果具有差异。另外本研究属于医院内病例对照研究，样本偏少，可能存在住院选择偏倚的情况，因此后续还需要进行较大规模的普查研究，以进一步证实研究结论以及进行更深入的研究。