孔道关键氨基酸残基对电压门控钾离子通道Kv2.1和Kv2.2离子选择性的调控

刘翠云，胡长龙

(复旦大学 生命科学学院，上海 200438)

哺乳动物电压门控钾离子通道(Kv)由12个亚家族(Kv1-12)构成,包括40个亚型.它们在膜电位维持以及介导神经元和肌肉的兴奋性方面发挥了关键作用,并且与多种神经和心血管疾病密切相关[1-3].从果蝇到脊椎动物,电压门控钾离子通道的结构高度保守[4].电压门控钾离子通道是四聚体结构,通过4个α亚基形成一个对钾离子具有选择性的孔道,每一个α亚基由6个跨膜螺旋(S1～S6)构成,且S5和S6之间通过P环连接,它们构成螺旋孔以及离子选择区域.电压门控钾离子通道在去极化时被打开,随着去极化时间的延长,随后进入失活状态.

电压门控钾离子通道的Kv2亚家族包括Kv2.1和Kv2.2两种亚型,它们对神经元电兴奋性和膜电位维持起重要的调控作用[5-6].Kv2.1普遍存在于哺乳动物大脑中,它通过控制膜电位的去极化和超极化来调控神经元的兴奋性[7-8];Kv2.2主要在前脑基底斜方体的中间核中表达[9],相比于Kv2.1,它的功能和生物学作用有待充分的探索.研究表明Kv2.1与多种病理和生理功能有关.例如，Kv2.1可以调控人体胰岛中胰岛素的分泌,即促进胰岛素的胞吐作用,揭示了该通道结构的破坏会导致人体胰岛素分泌途径受损,引发糖尿病[10-11];正常的衰老过程以及神经退行性疾病的发生伴随着Kv2.1的氧化[12];Kv2.1可以介导神经元的凋亡[13-14];Kv2.1功能的缺失会增加阿尔茨海默病小鼠模型中海马神经元的兴奋性,最终促成兴奋性毒性损伤[15].另外,越来越多的研究表明Kv2.2与睡眠周期的调控有关[16];Kv2.2参与胰岛对胰岛素和生长抑素释放的调控[17];对噪音引起的听力损伤也具有保护作用[18].Kv2通道的功能与通道失活特性及离子选择性高度相关.

电压门控钾通道有两种失活类型： N-type和C-type[19].这两种类型的主要失活机制是不同的,与N-type有关的结构域位于胞质中的氨基末端,N-type的失活机制可以用ball-and-chain模型来解释[20-21].目前认为C-type失活与选择性滤器周围的构象变化以及与其靠近的部分胞外结构有关[22-25],且在C-type失活的过程中,4个亚基都会参与其中,共同协作,使孔道外口收缩[26].通道所处的离子环境也会影响C-type的特性,在哺乳动物电压门控钾离子通道中细胞内阳离子的种类和浓度可以调控C-type外向电流失活的速率和幅度[27].在正常的情况下,钾离子通道可以特异性地允许钾离子通过,而不允许其他离子通过[28],已有研究结果表明,Kv通道孔道中的一段保守氨基酸序列-VGYGD-与通道对钾离子的高度专一选择性有关,该序列中的V和Y与跨膜区的W之间的氢键和范德华力是调控的关键[29].Kv通道的失活与离子选择性高度耦合,从晶体结构上看,Kv2.1和Kv2.2通道中保守序列-VGYGD-中的Y可能与孔道失活相关结构域中的W之间形成氢键.本文通过点突变以及膜片钳的方法,对这两个位点的相互作用对通道离子选择性的影响进行研究,实验结果将会为Kv2家族相关疾病的治疗提供重要的理论基础.

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾HEK293细胞,购买自中国科学院细胞库(上海,中国);大鼠Kv2.1(由Kcnb1基因编码),Kv2.2(由Kcnb2基因编码)通过酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ连入表达载体pEGFP-N1.所用质粒突变试剂盒QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit购买自Agilent Technologies公司.基因测序及引物合成服务由上海睿迪生物公司提供.所用转染试剂盒jetPRIME购买自Polyplus公司.

1.2 方法

1.2.1 点突变与质粒扩增

根据NCBI上的Kcnb1(NM_013186.1),Kcnb2(NM_054000.2)基因序列分别设计引物(表1)进行扩增.

表1 实验所用引物

点突变按照质粒突变试剂盒中的步骤进行,突变产物通过热击法转化大肠杆菌E.coliDH5α,挑选单克隆测序,确定测序结果正确后,大量扩增,使用质粒中抽试剂盒(由Axygen提供)抽提质粒并测浓度.

1.2.2 细胞培养和转染

细胞培养在含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养液中,置于CO2浓度为5%的37℃培养箱中培养.当HEK293细胞的生长密度达到60%到80%时进行转染,转染步骤按转染试剂盒中提供的说明书进行,加入的目的质粒的量为2μg,转染24h 后进行实验.

表2 实验所用内液/外液配方

1.2.3 电生理记录

HEK293细胞的全细胞电流记录使用Axon 200B放大器(美国Axon Instruments公司)和pClamp10.2软件进行记录.记录电极(德国Brand公司)经垂直拉制仪(Narishige公司Model PC-10 Puller)两步拉制而成,保证电极充满内液后的阻值范围是4～6MΩ,记录时的采样频率是10kHz,并以2kHz 滤波器减噪,实验在室温下进行.实验中所用的内外液配方见表2.

1.2.4 数据分析

电流数据分析统计软件使用Clampfit10.7和Origin8.0;作图软件使用PyMOL 2.2和CorelDRAW12.

2 结果与分析

2.1 Kv2.1关键位点W366的突变改变通道离子选择性

Kv1.2/Kv2.1的嵌合通道结构(PDB ID： 2R9R)包括S5到S6的跨膜螺旋以及S4到S5的链接螺旋结构,通道大小被缩减,孔道区域结构没有发生变化,使用PyMOL 2.2软件分析,显示在该结构中W363和Y373之间存在距离为2.84Å的氢键(图1(a));另外,结构生物学研究也表明,W366和Y376(Kv2.1的氨基酸编码)之间可能会形成氢键[30],这组氢键很可能影响通道选择性过滤器的功能,本研究通过实验的方法验证了氢键的存在.Kv通道亚型众多,孔道区域的氨基酸种类高度保守,图1(b)是本研究涉及的通道亚型及关键氨基酸位点.

图1 W366位点突变对Kv2.1的影响Fig.1 Effect of W366 mutation on Kv2.1

实验中激活电流的记录方法为： 将细胞钳制于-100mV,以200ms的间隔时间,从-100mV开始,每次递增10mV给予去极化刺激直到+40mV.野生型Kv2.1的电流记录结果如图1(c),外向钾电流在+40mV去极化电压刺激下可达到2000pA左右.将W366突变成A,电流记录结果如图1(d),结果显示,在同样的去极化电压刺激条件下,突变通道的外向钾电流几乎消失,出现200pA左右的内向电流,说明该位点的突变改变了通道的离子选择性.由于氨基酸间的氢键和氨基酸结构中的芳香环都可能是造成通道离子选择性变化的原因,为探究芳香环结构对通道离子选择性变化的影响,随后将W突变成同样有芳香环结构的F,实验结果显示通道依然出现离子选择性变化(图1(e)),这说明芳香环结构不是造成通道离子选择性变化的原因,而氢键的破坏是通道功能发生变化的主要原因.取不同去极化指令电压下内向电流峰值的均值做I-V曲线(图1(f)),可得到该内向电流是电压依赖性的,随着电压的增大,内向电流先增大后减小,当刺激电压是0mV时电流达到最大.

2.2 Kv2.2关键位点W374的突变改变通道离子选择性

将Kv2.2的相同位点突变,激活电流的记录方法同图1,野生型Kv2.2的电流记录结果如图2(a),外向钾电流在+40mV去极化电压刺激下可达到4000pA左右.将W374突变成A,电流记录结果如图2(b),结果显示,在同样的去极化电压刺激条件下,突变通道的外向钾电流几乎消失,出现200pA左右的内向电流,说明该位点的突变改变了通道的离子选择性.为探究芳香环结构对Kv2.2离子选择性变化的影响,将W374突变成F,实验结果与W374A类似(图2(c)),说明芳香环对Kv2.2离子选择性变化不产生影响,氢键的破坏是Kv2.2通道功能变化的主要原因.I-V曲线(图2(d))表明,突变通道W374A/W374F的内向电流也是电压依赖性的,随着电压的增大,电流先增大后减小,电压为0mV时电流达到最大.图1和图2的实验结果表明,该位点突变引起的通道离子选择性变化在Kv2亚家族中具有普遍性.

图2 W374位点突变对Kv2.2的影响Fig.2 Effect of W374 mutation on Kv2.2

2.3 内向电流是钠离子内流产生的

根据实验所用外液配方(见表2)分析可知,外液中的钠离子和钙离子内流都可以产生内向电流,随后实验中通过控制外液中的离子种类来确定内向电流的组成.激活电流的记录方法同图1,取+10mV钳制电压下的记录电流.如图3(a)～(b)所示,当把外液中2.5mmol的钙离子替换成等浓度的NMDG+,而保持钾离子和钠离子浓度不变时,Kv2.1 W366A/W366F内向电流相较于对照组没有显著性变化,当把外液中140mmol的钠离子替换成等浓度的NMDG+,而保持钾离子和钙离子的浓度不变时,内向电流消失.这一结果表明,突变通道Kv2.1 W366A/W366F产生的内向电流主要是钠离子内流造成的.突变通道Kv2.2 W374A/W374F在同样外液条件下的实验结果(图3(c)～(d)，见第600页)，也说明通道突变后产生的内向电流主要是钠离子内流造成的.

2.4 突变通道对其他一价阳离子通透性的研究

图3 不同外液离子条件对内向电流的影响Fig.3 The influence of ion condition of external liquid on the inward current

图4 Kv2.2突变型通道对其他一价阳离子的通透性Fig.4 The permeability to other univalent cations of Kv2.2 mutant channel

2.5 关键位点Y376,Y384的突变也会改变通道离子选择性

如果W363与Y373(Kv1.2/Kv2.1嵌合通道的氨基酸编码)之间存在氢键,则Y376,Y384的突变也会导致氢键的破坏,产生和W366,W374突变相似的现象.实验中我们将Kv2.1的Y376位点和Kv2.2的Y384位点均突变成F,激活电流的记录方法同图1,实验结果显示,通道突变后,外向钾电流消失,出现内向电流(图5(a),(b)).这一结果表明在在Kv2.1的W366与Y376之间,Kv2.2的W374与Y384之间可能会形成氢键,W366和Y376(Kv2.1的氨基酸编码)分别对通道功能产生影响.根据不同去极化电压指令下内向电流峰值的均值做I-V曲线(图5(c),(d)),可得到Kv2.1和Kv2.2该位点突变产生的内向电流也具有电压依赖性,随着电压的增大,内向电流先增大后减小,当刺激电压是0mV或10mV时电流达到最大.

图5 Y376F,Y384F突变对Kv2.1和Kv2.2通道功能的影响Fig.5 The influence of the mutation of Y376F, Y384F on the function of the Kv2.1 and Kv2.2 channels

3 讨 论

电压门控钾离子通道广泛分布于神经细胞中,参与静息电位的维持以及动作电位的产生,在神经调节过程中发挥关键性的作用,对电压门控的钾离子通道的研究意义深远.电压门控钾离子通道亚型众多,但是孔道区域氨基酸的种类在不同物种间保守,本研究主要利用点突变以及膜片钳记录的方法对钾离子通道的孔道区域的关键保守氨基酸位点进行研究.研究发现,除序列-TVGYG-外,在哺乳动物大鼠钾离子通道Kv2.1和Kv2.2中,W366与Y376(Kv2.1的氨基酸编码)之间形成的氢键也是调控钾离子通道离子选择性的关键,它的破坏使通道失去钾离子通透能力,而主要通透钠离子.

TVGYG序列在电压门控的钾离子通道中高度保守,也是电压门控钾离子通道的特征序列，早期通过点突变以及缺失突变的方法发现这一序列尤其是GYG序列在Shaker通道的离子选择性中起着关键性作用[29,36-37].后续的晶体结构以及计算机模拟实验的研究从多方面证实了这一特性序列对电压门控钾离子通道离子选择性的重要性，并进一步探讨了其影响离子选择性的作用机理[38-41].本研究中的突变位点Y376和Y384正是对应特征序列TVGYG中的关键Y位点,我们实验发现在生理条件下突变通道的离子选择性发生显著改变,进一步说明了从果蝇到哺乳动物大鼠,Y位点在电压门控钾离子通道的离子选择性中的重要作用.

在非生理条件(内液中无K+)下,Shaker通道的突变型W434F会使通道失活,同时会通透钠离子[42-43].同时有研究结果表明,Shaker通道的突变型W435F对通道的失活和离子选择性不产生影响[44].本研究发现在生理条件下,Kv2.1孔道关键氨基酸W366(等同于Shaker的W435)和Y376发生突变后,外向钾电流消失,说明通道突变后失活.类似于Shaker的突变型通道W434F,Kv2.1失活后也能记录到电压敏感性的内向钠电流,与之不同的是该内向钠电流是在生理条件(内液中有K+)下记录到的.Y376F对Kv2.1通道的影响与W366位点突变后的现象相同.通道关键位点突变后的现象在Kv2.1和Kv2.2中具有普遍性.这说明W366和Y376以及W374和Y384之间的氢键对哺乳动物电压门控钾离子通道的失活和离子选择性的调控发挥关键作用.

前人研究表明电压门控钾离子通道的C-type失活在结构上与靠近胞外侧选择性滤器的结构相关(见前言部分),有研究发现通道外孔和孔螺旋区域的氨基酸残基的相互作用对C-type失活过程中选择性滤器功能的维持起关键作用[45-46],另外,孔螺旋区域的氨基酸残基也可以和选择性滤器结构相互作用,影响孔道的慢失活[42,45].同时,研究发现电压门控钾离子通道Shaker和Kv2.1在C-type失活过程中表现为对钾离子的通透性变弱,对钠离子的通透性变强[47-48],与本研究的实验现象相似,Shaker的突变型通道W434,在非生理条件下发生永久失活及通道离子选择性的显著变化[42],本研究中通道的失活及离子选择性因关键位点氨基酸突变也发生显著改变,我们推测在哺乳动物大鼠Kv中,决定C-type失活和通道离子选择性的结构在位置上靠近,功能上相偶联,具体的机理有待于进一步的探索.

本研究中关键位点氨基酸的突变很可能会引起选择性过滤器结构稳定性和构象的变化.已有研究发现,在Kv通道C-type失活过程中选择性滤器及其胞外结构域的构象变化会影响离子的通透[46],链霉菌钾离子通道KcsA选择性滤器结构的变化也会影响离子的通透[49-50].Kv2.1和Kv2.2孔道区域关键位点氨基酸的突变使原有氢键破坏，很可能降低孔道区域结构稳定性或构象改变，使通道倾向于通透半径较小的离子.结构方面微观层次的变化有待于进一步研究.