酶底物法检测水中总大肠菌群

田立平, 邢峰杰, 王晓波

(潍坊市市政公用事业管理处，山东潍坊261041)

与传统的多管发酵法、滤膜法相比，采用酶底物法检测总大肠菌群具有操作简便、检测时间短、无需进行确认试验等优势，广泛应用于水质检测等行业。酶底物法和滤膜法、多管发酵法对总大肠菌群的检测结果具有一致性，不存在统计学差异[1-4]。笔者结合实际情况，对酶底物法检测总大肠菌群过程中的质量控制因素进行了研究，以期为今后的工作提供参考与支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

科立得试剂、97孔定量盘、97孔阳性比色盘、程控定量封口机、DHP-9080电热恒温培养箱。

实验室用水：采用MilliPore纯水系统制备纯水，经平皿计数等实验检测符合实验要求。使用时用121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，制成无菌水。

1.2 样品来源

潍坊市峡山水库地表水、潍坊市某地区地下水、潍坊市中心市区管网水以及饮用水总大肠菌群质控标样(批号为022718-1和021518)。

1.3 检测方法

根据《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12—2006)中的酶底物法和《城镇污水水质标准检验方法》(CJ//T 51—2018)中的酶底物法进行检测。

2 结果与分析

在采用酶底物法检测饮用水总大肠菌群过程中，实验室内的质量控制硬件主要包括电热恒温培养箱、冰箱、立式高压蒸汽灭菌器以及培养基等。在电热恒温培养箱和冰箱的使用过程中，采用检定合格的温度记录仪测定温度，控制箱内温度与设定温度差在±0.5 ℃内；定期用化学指示卡或者生物灭菌指示剂，检测立式压力蒸汽灭菌器的灭菌效果；培养基例如科立得试剂在使用前，进行大肠埃希氏菌标准菌株阳性实验和无菌性测试。质控样品标准值为91±12 MPN/100 mL，从表1可以看出验证合格。软件方面影响因素主要包括检测时间、取样容器、培养时间以及检测环境等。影响因素中的生物实验先进行空白实验，例如纯水、培养基等。

表1 科立得试剂符合性验证 MPN·100 mL-1

2.1 检测时间对检测结果的影响

微生物样品所规定的保存时间为4 h[5]，但实际工作中会存在因外出取样路程太远等情况，不能在4 h内及时检测。针对全年温度变化，采用实际水样和质控样品对冬天(4 ℃)、春秋(20 ℃)以及夏天(35 ℃)取样运输过程中保存时间对结果的影响进行分析。

2.1.1 实际水样

采用无菌水对污水出厂水按一定比例稀释、混匀，配制得到试验水样。对同一水样，在不同保存温度和时间下的检测结果如图1所示。20和35 ℃条件下水样保存2 h后，结果变化很大；随着时间的延长，结果呈现无规律变化；4 ℃下冷藏保存24 h内，检测结果稳定，而24 h后呈现无规律变化。

图1 检测时间对实际水样总大肠菌群检测结果的影响

2.1.2 总大肠菌群质控样品

用已灭菌的管网水将总大肠菌群质控样稀释10倍，稀释后的标准值为9.1±1.2 MPN/100mL，可接受范围为2.9～28.4 MPN/100mL。从图2可以看出，在4 h内对4，20和35 ℃下保存水样的检测结果比较稳定。随着时间的延长，20和35 ℃下保存的水样的检测结果显著变化，4 ℃冷藏条件下的水样在24 h内结果变化不大，且随后均呈现下降趋势。

图2 检测时间对总大肠菌群质控样检测结果的影响

2.2 取样容器对检测结果的影响

目前常用的微生物取样容器有玻璃瓶、无菌塑料瓶、无菌采集袋等，而微生物具有吸附性，存放过程中不同的容器对检测结果的影响程度可能存在差别。采用生活饮用水管网水、地表水、地下水、质控样品共4类11个样品对这3种容器分别进行试验，其中质控样品批号为022718-1，用已灭菌的实际水样稀释10倍，结果见表2。通过SPSS软件配对t检验分析，p>0.05，3种容器的检测结果不存在显著差异。

表2 取样容器对检测结果的影响 MPN·100 mL-1

2.3 培养时间对检测结果的影响

对总大肠菌群质控样品(标准值为91±12 MPN/100mL)进行酶底物法检测，不同培养时间后的检测结果如图3所示。培养22～28 h后的检测结果在标准值附近，用SPSS软件分析表明，培养15～21、29～33 h后的检测结果与标准要求的24 h相比均有显著性差异，因此检测总大肠菌群最佳的培养时间为22～28 h。

图3 培养时间对检测结果的影响

2.4 检测环境对检测结果的影响

取生活饮用水管网水、地表水、地下水和总大肠菌群质控样品4类水样，其中总大肠菌群质控样品标准值为214±17 MPN/100 mL，可接受度范围为69～668 MPN/100 mL。对每类样品分别在无菌环境和非无菌洁净室条件下进行检测，结果见表3。通过SPSS软件配对t检验分析p>0.05，4类水样7个样品在无菌环境和非无菌洁净室下的检测结果差异不显著，酶底物法检测总大肠菌群对检测环境无严格要求。

表3 不同检测环境下的总大肠菌群检测结果 MPN·100 mL-1

3 结论

① 微生物样品采集后若不能在4 h内完成总大肠菌群的检测，须立即置于4 ℃冷藏保存，并在24 h内完成检测，在夏季高温和春秋季取样时要特别注意。

② 取样采用玻璃瓶、塑料瓶和采集袋，对总大肠菌群检测结果的影响程度无显著差异。但考虑到塑料瓶和采集袋易破损等因素，建议首先选择硬质玻璃瓶取样。塑料瓶和采集袋为一次性无菌取样容器，可在应急样品取样或大批量的取样缺乏足够灭菌玻璃瓶的情况下使用。

③ 采用酶底物法检测总大肠菌群，培养时间宜控制在22～28 h。该方法对所处环境是否无菌无严格要求，可以应用于室外应急检测工作。