3株少孢节丛孢菌分离株通过绵羊消化道试验的评估

潘 红，罗斌汉，赵睿明，曾曼溢，孙雨琪，罗千慧，候俊达，蔡葵蒸

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

家畜寄生虫病是危害我国畜牧业经济生产效益的主要因素之一。目前，人们对家畜寄生虫病危害的处理方式主要依赖于药物防治，并相继研发了一系列高效、广谱、低毒的驱虫药，这对家畜寄生虫病的防控发挥了重要作用。但随着驱虫药的长期使用，导致寄生虫对药物产生了耐药性[1,2]。长期使用药物不仅会导致家畜体弱消瘦，而且家畜体内残留的药物还会给人们的身体健康带来安全隐患，药物残留也会对环境造成一定的污染。所以，生物防控成为了未来寄生虫病防治的主要研究方向[3,4]。研究发现，土壤中含有多种捕食性线虫真菌，可以通过形成特殊的菌丝结构来感染线虫，筛选和利用这些真菌作为植物和动物寄生线虫的生物防治剂，具有广阔的应用前景，其中少孢节丛孢（A.oligospora）是自然界最为常见而且目前最为广泛和深入研究的一种捕食性线虫真菌[5-8]。本研究的目的是进一步探讨该菌通过消化道后对体内幼虫的捕杀效果，为今后利用这种捕食性真菌开展动物寄生线虫病的生物防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

少孢节丛孢 (A. oligospora)，分离株编号为F35、F88和F79，这3株菌均来自西北民族大学蔡葵蒸教授课题组，菌株在4 ℃下2%玉米粉琼脂斜面培养基保存。

1.2 培养基及其制备

本研究使用的培养基主要为水琼脂培养基（WA），麸皮琼脂培养基（WSA），液体培养基，产孢培养基。

水琼脂培养基（WA）：按照2%的浓度将琼脂粉加入到水中，高压灭菌后在超净工作台内倒制平板。

麸皮琼脂培养基（WBA）：4%麸皮原液的制备：称量40 g麸皮，量取1 000 ml水，加热保持微沸一小时并不断搅拌。八层纱布过滤后，置于2 000 ml量筒用保鲜膜密封（量筒里的水加至1 000 ml），6 ℃冰箱静置10 h，吸取上清液，稀释至所需浓度，再加入2%的琼脂粉。高压灭菌后，在超净工作台内倒制平板。

液体培养基：按照上述方法制备浓度为4%的麸皮原液，稀释至2%。每个锥形瓶加入80 ml稀释好的2%麸皮原液，高压灭菌121 ℃，20 min即可。

产孢培养基：粮食培养基的总重量为60 g，主要成分是玉米和小麦，其比例是2：1，按照比例称取小麦和玉米放入250 ml锥形瓶加入1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4以及适量的蒸馏水，粮食与蒸馏水的比例是1.5：1，用硅胶塞盖住并用牛皮纸将其瓶口包好，整体放入高压锅内，温度设置为121 ℃，时间为30 min进行高压蒸汽灭菌即可。

1.3 菌种的扩繁和分生孢子的生产

在超净工作台内，将2%玉米粉琼脂斜面培养基保存的菌株在无菌条件下用接种环挑出少量菌丝体连同培养基，接种在WA培养基中央，置于28 ℃培养箱中培养一星期左右。若WBA平板培养基中接种的真菌生长良好，则可以在超净工作台内将已培养好的真菌用灭菌的手术刀切下5 mm×5 mm大小的布满菌丝的琼脂块接种到液体培养基中，每瓶5块，放置在转速为160 r/ min，温度为28 ℃的摇床中培养5～7 d后，在超净工作台内使用震荡仪上震荡5 min，取3 ml菌液接种到产孢培养基，置于28 ℃培养箱中培养1个月后用0.05%（w）Twain-80水溶液清洗长有真菌的玉米粒，将清洗过粮食的吐温用两层纱布过滤，得到含有孢子的过滤液，稀释浓度至5×105个/ ml。

1.4 试验动物

用左旋咪唑，对三月龄绵羊进行驱虫，21 d后，直肠取粪进行虫卵检查，以判断体内寄生虫是否驱除干净。如检查合格，使用注射器，将已准备好的8 000条捻转血矛线虫的三期幼虫灌入绵羊胃内，21 d后收集粪便，再次进行虫卵检查，以确认线虫是否接种成功。收集粪便于白瓷盘中弄碎，置于25 ℃培养箱培养7 d，期间定期搅拌并保持湿度，7 d后将搅拌均匀的粪便顶置于白瓷盘的盖子上，第二天将盖子上的虫液用蒸馏水冲下，收集于烧杯中，然后通过贝尔曼法将虫液中的粪渣除去，最后收集于细胞瓶中备用。

1.5 体内试验

将一定浓度的孢子液给绵羊灌服，灌服后套上粪袋收集粪便，将真菌灌服后24 h内收集的粪便记为t1，48 h后收集的粪便记为t2，7 d后收集的粪便记为t3，根据Cai等[9]的工作显示真菌在灌服120 h（±1）后孢子不太可能仍然存在，因此t1和t3采集的样品能够用作t2的样品的未处理对照。这允许每只动物作为试验的实验单位。在每次取样时，为每只动物的粪便培养物制备3个重复。

将每次收集的粪便捣碎后称取10 g放入小平皿，加入少量水进行搅拌，将小平皿放入大平皿中，在大平皿中加入适量的水以保持湿度，最后放入26 ℃温箱培养两周，期间每隔三天进行一次搅拌并添加适量水分保持湿度，两周后进行幼虫计数。

通过贝尔曼漏斗法分离幼虫，并按Cai等[9]的方法计算L3百分减少率。

1.6 数据统计分析

计算公式中每组均有三个平行组，t1和t3作为对照组，t2则为实验组，从而计算出体内杀虫率。然后通过spss软件对幼虫减少率使用t检验显著性方差分析。

2 结果

从表1中可以看出灌服F35的粪便不同时期的粪便中L3数量差距均较大，而另外两株菌的不同时期粪便中L3差距不是很明显，尤其是F79三个时期差距都不大。

图1显示了3株A. oligospora对绵羊胃肠消化道线虫捻转血矛线虫L3的捕杀效果。结果显示，有2株少孢节丛孢菌株（F88，F79）在灌服后可以通过绵羊消化道，并对L3的捕杀效果差异显著，一株（F35）不显著，通过绵羊消化道后对粪便中三期幼虫的捕杀率分别为46.00%, 99.47%, 17.84%。

图1 三株少孢节丛孢通过绵羊消化道后对粪便中L3的捕杀率

3 讨论

本试验通过对3株A. oligospora通过绵羊消化道能力的试验，结果表明，F88和F79的两个分离株对绵羊体内三期幼虫的捕食能力较弱，均低于50%，其中F79可以判定为无效，而F35使三期幼虫的发育减少了99.47%，具有显著的杀虫效果。在不考虑灌服不准确等人为误差外，分析其可能的原因与菌株自身差异有关，根据之前对A. oligospora体内外杀虫实验的报道[9]，该菌通过绵羊消化道的能力与D. flagrans相比很不稳定，不同地理分布的菌株的少孢节丛孢通过消化道的能力不同，而生存能力强的少孢节丛孢在通过绵羊消化道后仍能保持较强的捕食能力，明显的减少L3的发育。此外，根据一些研究报道[9,10]，不同生长阶段的A. oligospora对不良环境的抵抗力存在差距，A. oligospora的营养菌丝对动物消化道的耐受力不如分生孢子强，故所灌服A. oligospora分离株产孢能力的大小也会对试验结果造成一定的影响。

通过分离株通过动物消化道的筛选实验，A. oligospora的一些菌株具有通过绵羊消化道的能力，其中个别菌株还能保持较高的捕食效果，这也证实了捕食线虫性真菌A. oligospora在临床应用方面的价值和发展潜力，尤其是对消化道有较强耐受力的菌株，有望成为一种潜在的饲料添加剂应用到实际生物防治中。

表1 三株少孢节丛孢通过绵羊消化道后从粪便中获得的L3数量