哈尔滨市动物源性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

姜慧宇,魏 娜

(吉林大学第一医院 第一手术室,吉林 长春130021)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SAU )有较强致病性，具有分布广、传播途径多样的特点。近年来由于广谱抗菌药物的乱用及滥用，SAU耐药性不断增强，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)成为多重耐药医院感染最常见的革兰阳性菌，是医院感染重点监测对象[1]。金葡菌感染可以引发多种疾病，包括皮肤和软组织感染(SSTI)、肺炎、心内膜炎、菌血症和败血症[2]。该病原体还可引起反刍动物(牛、绵羊、山羊等)、家禽和猪的大规模感染[3]。为了对哈尔滨市动物源性金黄色葡萄球菌的耐药情况做一个大体性调查，以便后续的耐药机制、传播规律及与人型菌株的关系研究，在哈尔滨部分地区的养殖场分离鉴定了部分金黄色葡萄球菌，并测定了这些菌株对临床常用抗菌药物的敏感性。

1 材料与方法

1.1 样本采集及处理所有样本于 2017年 6 月至 8月采集于南岗区1个养鸡场(养鸡场1)、1 个养猪场(养猪场1)，香坊区 2个养鸡场(养鸡场 2，养鸡场3)、1个养猪场(养猪场2)和1 个养牛场(养牛场 1)，五常市1个养鸡场(养鸡场 4)和1个养牛场(养牛场2)， 宾县1个养猪场(养猪场3)。对动物粪便样本进行采集，用无菌棉签取 0.3 g 左右的粪便盛于1.5 ml灭菌离心管；所有采集的样本均置于车载冰箱中，12 h之内进行处理。在每个装有样本的离心管中加入1 ml无菌生理盐水震荡后静置2 h以释放细菌，再次震荡混匀后吸取 0.2 ml液体于 Mueller-Hinton 高盐培养基中培养8 h。每个平板挑取 1-3个浅黄色或黄色的疑似金黄色葡萄球菌菌落划线于 NB固体平板，37 ℃培养12 h后进行革兰染色观察细菌形态。

1.2 PCR检测根据王豪举[4]等学者的文献，合成特异性引物，上游引物为F：5′-A G GGAT GGC TATC AGTAATGTTTC- 3′，下游引物为R：5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′。PCR 反应体系：2×Taq Master Mix 10 μl，F(10 μmol/L)0.5 μl，R(10 μmol/L)0.5 μl，模板 0.5 μl，ddH2O 8.5 μl，总反应体系20 μl。PCR 反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，共30 个循环；最后 72 ℃延伸 6 min。反应结束后取 5 μl反应产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.3 药敏试验分离的菌株对22种抗菌药物的敏感性用纸片法进行测定。测定结果参照《动物源细菌抗菌药物敏感性试验纸片法与稀释法执行标准(2013版)》、《抗菌药物敏感性试验执行标准；第二十三版资料增刊》进行判定，具体操作方法参照张倩[5]与杨延成[6]等学者的方法。

2 结果

2.1 菌株分离结果将平板上疑似为金黄色葡萄球菌的菌落经 PCR 扩增后，最终共鉴定出17株金黄色葡萄球菌(图 1)，包括 10株鸡源菌株(泳道 1-10)、6株猪源菌株(泳道 12-17)，1株牛源菌株(泳道 18)。在南岗区共分离5株金黄色葡萄球菌，其中养鸡场1 分离鸡源菌株 3 株， 记为1-3 号菌， 养猪场1分 离猪源菌株 2株，记为4，5号菌； 香 坊 区共分离7株金黄色葡萄球菌，其中养鸡场2分离鸡源菌株1株，记为6号菌，养鸡场3分离鸡源菌株2株，分别记为7号及8号菌；养猪场2分离猪源菌株3株，记为9-11号菌；养牛场1分离牛源菌株1株，记为12号菌。在五常市共分离4株金黄色葡萄球菌，均来自养鸡场4，记为13-16号菌。在宾县养猪场3分离一株猪源菌株，记为17号菌(表1)。

图1 17株临床分离株的PC R 鉴定结果

表1 金黄色葡萄球菌样品采集及菌株分离

2.2 耐药性分析17株临床分离株动物源性金黄色葡萄球菌的药物敏感性试验结果见表2和表3。实验结果显示，所分离的17株金黄色葡萄球菌中14株对青霉素G耐药，耐药率为76%；对庆大霉素及头孢拉定耐药的菌株均为 10株 ，耐药率均为59%；对阿莫西林、链霉素及红霉素耐药的菌株均有8株，耐药率均为47%；对大观霉素、阿米卡星、思诺沙星、乳酸环丙沙星及磺胺异恶唑等五种抗菌药物耐药的菌株均为7株，耐药率为41%；对氨苄西林、卡那霉素、氧氟沙星、复方新诺明、呋喃唑酮、四环素及强力霉素等7种药物耐药的菌株数均为6株，耐药率为35%；对诺氟沙星、林可霉素和万古霉素耐药的菌株数均为5株，耐药率为29%；对氯霉素耐药的菌株数最少，仅为4株，耐药率为24%。分离自南岗区的3株鸡源菌株对青霉素G和头孢拉定耐药；2株猪源菌株对头孢拉定和链霉素耐药。

分离自香坊区的3株鸡源菌株对青霉素G耐药，且对复方新诺明表现敏感；3株猪源菌株对头孢拉定耐药，且对氧氟沙星和林可霉素较为敏感；一株牛源菌株对9种药物耐药。分离自五常市的4株鸡源菌株对庆大霉素、复方新诺明及林可霉素的耐药率高达75%。分离自宾县的1株猪源菌株对22中常用药中的10种耐药。

所有菌株的实验结果显示，β-内酰胺类的抑菌效果较差，细菌在该类药物中产生的耐药性较高；氨基糖苷类药物的抑菌效果较β-内酰胺类药物略显优势，17株菌株中对该类药物耐药的数量较前者少；氯霉素类药物(本实验特指氯霉素)的抑菌效果最好，菌耐药率为24%，17株菌中仅四株对该药显示耐药性。不同动物来源的菌株对药物的耐药性并未显示出明显偏好性，但鸡源菌株的耐药性明显高于猪源和牛源的菌株，牛源菌株的耐药性普遍较前两者低。多重耐药菌株的耐药特性从5种到13种不等，分别为5种、8-13种。多重耐药多集中在9种-11种。8种、12种及13种均只有1株菌，5种和 9种各有2株菌，11种有3株菌，10种均有6株菌。10种及以上的菌株数占所有分离菌株数的65%。

表2 17株临床分离株的抑菌圈直径及药物敏感性结果

A无NCCLS 标准，敏感度判定参照头孢唑啉;B无NCCLS 标准，敏感度判定参照阿米卡星;C无NCCLS 标准，敏感度判定参照氧氟沙星;D无NCCLS 标准，敏感度判定参照呋喃妥因;E无NCCLS 标准，敏感度判定参照阿奇霉素。

3 讨论

某些抗生素类药物在国家已经禁止使用的情况下，某些分离菌仍显示较高抗性，与养殖场的饲料及环境不无关系[7]。分离菌株对青霉素G的抗性较其他药物明显强，可能与养殖场日常感染的常用药有关。不同动物源性菌株对药物的敏感性亦存在一定差异，如猪源菌株对头孢拉定的耐药率高于鸡源菌株，这可能是由于头孢拉定作为养猪场预防用药有关。由于牛源细菌分离获得菌株数较少，在此不作讨论。

金黄色葡萄球菌是人类临床上重要的病原菌之一，是导致血液感染、心内膜炎等的元凶之一，由金黄色葡萄球菌引起的致病率和死亡率有连年增高的趋势，金黄色葡萄球菌作为一种致病菌正严重威胁着人类的健康发展[8]。在临床上，金黄色葡萄球菌的耐药现象正日益加剧，以对甲氧西林耐药为代表的金黄色葡萄球菌(MRSA)，为控制金黄色葡萄球菌性疾病的流行、传播和临床治疗带来了极大挑战，MARA也被称为“超级细菌”[9]。金黄色葡萄球菌致病的主要机制是释放毒素，可引起机体出现非特异性炎症反应，并引起严重的败血症，最终导致死亡。目前金黄色葡萄球菌研究较多的毒力因子有：血浆凝固酶、Pantone-Valentine(PVL)杀白细胞素、中毒性休克素I(TSST-I)、金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)等[10]。

表3 分离菌株对抗生素的耐药情况

本实验涉及哈尔滨及周边地区，范围较广，共采集550份样本，分离并检定获得104株细菌，经进一步测序及BlastN比对，共确定17株金黄色葡萄球菌， 分离率为3.1%，样本的总分离率较高，但由于距离原因，某些样本处理不够及时，也造成分离菌株数量的一定误差。本实验仅对分离获得的细菌耐药性进行初步讨论，针对细菌的耐药机制并未进行深入讨论，下一步将会针对不同来源的细菌耐药性原因做进一步研究讨论，并进行统计学分析。