VEGF表达下调抑制人宫颈癌细胞增殖转移相关机制研究

史爱英

(锦州市中心医院 妇产科,辽宁 锦州121000)

宫颈癌(CC)是严重威胁妇女健康和引起妇女死亡的主要原因[1]。研究发现VEGF在调控肿瘤血管生长、浸润、转移中发挥关键作用[2,3]。本研究中，通过建立CC细胞株，并通过干扰VEGF表达，检测VEGF下调对CC细胞的存活及凋亡的影响，从而进一步深入探索VEGF在CC发病中扮演的角色，为临床开发更加高效合理的治疗方案奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

人宫颈癌Hela细胞株购自北京中国医学科学院肿瘤研究所。根据已有方法[4]，将HeLa细胞培养于培养基中，然后置于CO2培养箱中培养。选对数生长期细胞，将其随机分为2组：Control组(只加Lipofectamine)，VEGF干扰组(给予VEGF-siRNA处理，si-VEGF组)。将细胞接种于96孔板(密度为4×103/孔)，并根据lipofectamine RNA imax说明书对细胞进行转染。

1.2 划痕实验

转染后24 h，用200 μl枪头在两组细胞分别制造均匀划痕。经PBS漂洗后置于培养基中培养。于培养0 h和24 h，分别检测各组划痕。

1.3 CCK-8试验

将稳定感染后的两组细胞接种于96孔板，并设置6个复孔。于细胞培养后不同时间点(12 h、24 h、36 h、48 h和72 h)，在各组细胞分别加入CCK-8试剂(10 μL/孔)后继续培养4 h。然后，通过酶标仪检测450 nm波长处各孔OD值。

1.4 蛋白免疫印迹实验(Western blot assay)

取VEGF干扰后48 h的Control组和si-VEGF组细胞，根据BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书分别提取各组细胞总蛋白，并检测蛋白浓度。通过SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭后加入一抗(Bax,1:500，购自Abcam公司;Bcl-2,1:1000，购自Abcam公司)，4 ℃过夜。其后， PBS漂洗后加入二抗，并室温孵育1 h。最后，采用Bio-Rad 凝胶成像系统( GEL DOC EZ IMAGER，Bio-rad，California，USA)进行曝光，并使用Image J软件对目的条带进行灰度值分析。

1.5 统计学方法利用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析。两样本采用t检验，P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 VEGF干扰对Hela细胞迁移的影响

为了探索VEGF干扰对Hela细胞迁移的影响，我们在细胞干扰后实施了细胞划痕实验，并且于划痕后0 h和24 h分别进行拍照。实验结果显示，转染24 h后Control组划痕因细胞迁移明显变窄(图1 A-B)，而si-VEGF组划痕仍保持较宽水平(图1 C-D)。

2.2 VEGF干扰对Hela细胞增殖的影响

CCK-8试验检测结果显示，细胞培养后36 h si-VEGF组细胞活性低于Control组，但无统计学差异(P>0.05,图2)；细胞培养48 h和72 h，si-VEGF组细胞活性均明显低于Control组(P<0.05,图2)。

图1 VEGF干扰抑制Hela细胞迁移

(A,C)显示Control组和si-VEGF组划痕后0 h细胞情况；(B,D)显示Control组和si-VEGF组划痕后24 h细胞迁移情况。

图2 VEGF干扰抑制Hela细胞增殖

Control组只加入Lipofectamine，si-VEGF组给予VEGF-siRNA处理。*P<0.05，与Control组比较。

2.3 VEGF干扰后对细胞Bax/Bcl-2蛋白表达的影响

为了检测VEGF干扰对Hela细胞Bax/Bcl-2蛋白表达的影响，我们通过蛋白免疫印迹实验分别检测VEGF干扰后48 h Control组和si-VEGF组Bax/Bcl-2蛋白表达水平。结果表明，与Control组比较，si-VEGF组Bax蛋白表达明显增加(P<0.05,图3A,C)，而Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05,图3B,D)。

图3 VEGF干扰对Hela细胞Bax/Bcl-2蛋白表达的影响

(A,C)显示VEGF干扰后Control组和si-VEGF组Bax蛋白表达水平；(B,D)显示VEGF干扰后Control组和si-VEGF组Bcl-2蛋白表达水平。*P<0.05，与Control组比较有统计学差异。

3 讨论

CC是导致发展中国家妇女死亡的主要原因[5，6]。研究发现诱发CC的主要因素包括人乳头瘤病毒感染[7]、吸烟、年龄过早的性交、性伴侣数量过多和慢性免疫抑制等[8]。目前，手术、放/化疗是治疗CC的主要方法[9]。然而，由于CC的临床症状和体征直到癌症晚期才出现，因此导致CC治疗效果较差。因此，找到一种更加合理、高效的检测方法和治疗靶点，是提高CC患者预后，减少CC死亡率的有效方法。

肿瘤的生长和转移必须依赖丰富的营养供给，而血管生成是营养物质运输的重要条件[10]。研究表明，VEGF能促进肿瘤血管内皮细胞增殖、侵袭和血管形成，从而加速肿瘤形成和转移[11-13]。Saharinen P指出VEGF能够改变淋巴管内皮黏附特性，增加细胞/趋化因子分泌，从而促进肿瘤细胞增殖[14]。Fujimoto J等发现VEGF高表达能够促进CC患者淋巴结转移，导致患者预后较差，生存率明显降低[15]。在本实验中，我们发现VEGF干扰后表达下调能明显抑制CC细胞的增殖和转移，该实验结果与过去研究结论相符。本研究进一步证明了VEGF在CC中同样发挥重要作用，是促进CC增殖和转移的关键因素。此外，VEGF干扰后Bax蛋白表达上调和Bcl-2蛋白表达下调也证明VEGF的表达与凋亡相关蛋白密切相关。综上所述，本实验研究将有助于进一步深入阐明VEGF在CC中的相关分子机制，为临床开发新的治疗靶点和制定更加合理有效的治疗方案提供更好的理论支持。