微流控平台技术检测循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌早期诊断的初步研究

丁光贵，王小艳，万 军，丁培堃，黄同海

(1.深圳市人民医院 胸外科,广东 深圳518020;2.深圳市蛇口人民医院社区卫生服务中心,广东 深圳518020)

非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率死亡率均位居恶性肿瘤第一位[1,2]。研究表明，可通过检测肺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTC)对肿瘤转移和复发进行早期诊断[3]。本研究选取了一种基于微流控平台的循环肿瘤细胞分选仪器，通过对分选出的CTC通过免疫化学染色计数，与常规肿瘤标记物进行对比，探讨CTC检测用于NSCLC早期诊断的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

观察对象为2017年01年至2019年01月期间在深圳市人民医院确诊为NSCLC的65例癌症患者。入组标准：年龄18-80周岁，性别不限；病理诊断为NSCLC患者，所有患者均接受肺部CT扫描，腹部B超，全身骨ECT，头颅MRI及相关实验室检查以明确分期及远处转移；既往无肿瘤病史；入院前未接受抗肿瘤的相关治疗。排除标准：临床检验判定小细胞肺癌或其他恶性肿瘤；合并其他肿瘤患者。本研究已经过医院医学伦理委员会批准，患者对研究知情并签署知情同意书。

1.2 材料和仪器

NCI-H1975 (非小细胞肺癌细胞系)购自中国科学院细胞库，活细胞荧光染料Celltracker CMFDA(货号：C7025)、细胞核染料Hoechst33342(货号：H1399)、磁力架(货号：A31543)购自美国Thermo Fisher公司；低速大容量离心机购自上海安亭科学仪器厂；垂直混合仪和微型水平脱色摇床购自江苏海门其林贝尔公司；微型台式真空泵购自上海斯曼峰医疗器械公司；荧光显微镜及单细胞挑取系统购自奥林巴斯(深圳)工业有限公司，ClearCell○RFX1循环肿瘤细胞活性分离系统购自新加坡的Clearbridge生物医学公司，CTC鉴定染色过程的细胞固定液、透化液、封闭液、抗体稀释液、抗体混合液(含偶联过氧化氢酶pan-CK-抗体和偶联碱性磷酸酶CD45)、酶显色底物等配套试剂由深圳华大生命科学研究院提供支持。

采用化学发光法检测肿瘤标记物NSE(货号：CPO11070)、CEA(货号：CPO11050)、Cyfra21-1(货号：CPO11040)由深圳市人民医院检验科采用上海透景生命科技股份有限公司相关试剂盒检测。

1.3 检测方法

1.3.1细胞培养 NCI-H1975细胞用含有10%热灭火胎牛血清100 IU/ml青链霉素的1640培养基培养，培养的细胞用DPBS 磷酸缓冲液洗涤2次后用0.25%胰蛋白酶消化传代或收获细胞。

1.3.2细胞掺入与细胞回收率统计 NCI-H1975细胞培养至融合度约为80%后用胰酶进行消化，加入Celltracker CMFDA染色工作液，于细胞正常生长条件下孵育30 min。换用新鲜培养基继续培养30 min，将细胞用PBS漂洗后，在荧光显微镜下使用单细胞挑取系统挑取准确数量的细胞，按照5CTC/3 ml、25CTC/3 ml、50CTC/3 ml掺入全血中，每组设3个组内平行。

分别按照CTC定量检测试剂盒及ClearCell○RFX1循环肿瘤细胞活性分离系统说明书进行CTC分离操作，得到的细胞悬液置于96孔板中，在荧光显微镜下进行观察计数。按以下公式进行回收率计算：CTC回收率=观测CTC数量/掺入CTC总数×100%。

1.3.3CTC的定量检测 每位受试者采5 ml血液样本，用含肝素钠的BD Vacutainer管收集后保存于4℃冰箱，并且在采集后6 h内进行处理。CTC的定量检测按照ClearCell○RFX1循环肿瘤细胞活性分离系统说明书进行操作。CTC分离后，按照迈新生物双重免疫化学染色标准步骤进行染色鉴定，在荧光显微镜明场下进行观察并计数。

1.4 统计学处理

使用SPSS20.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC分离回收效率

通过CTC分离回收效率公式计算标记并染色的NCI-H1975细胞回收效率。实验结果显示，通过循环肿瘤细胞渗入实验，NCI-H1975细胞的回收率为(83.3-86.3)%，平均值为(85.0±1.5)%(表1)。

表1 循环肿瘤细胞回收情况

2.2 细胞形态鉴定

为确定经免疫化学染色鉴定后的肿瘤细胞形态特征，我们先对NCI-H1975肺癌细胞系、正常人外周血单核细胞PBMC进行了染色鉴定，染色后肿瘤细胞呈现典型的红色，PBMC染色后呈现典型的蓝黑色，形态特征见下图1。

图1 NCI-H1975和PBMC细胞染色后40倍显微镜下细胞形态图

2.3 纳入病人临床信息

本研究共纳入65例NSCLC患者的相关信息，其中男性患者38(58.5%)例，女性患者27(41.5%)例。患者的平均年龄为58.6(25-79)岁，Ⅰ期患者17(26.2%)例，Ⅱ期患者16(24.6%)例，Ⅲ期患者14(21.5%)例，Ⅳ期患者18(27.7%)例。

2.4 微流控平台与常规肿瘤标志物检测结果对比

为了评估CTC检测在NSCLC术前辅助诊断的价值，我们对65例NSCLC患者的临床全血样本进行了检测，并与临床常规肿瘤标志物进行对比分析。在65例NSCLC样本中，大部分有CTC检出，但在早期检出的CTC数量较少。I期中8例没有检出，有6例只有1个CTC检出；Ⅱ期中有6例只有1个CTC检出，6例有2个CTC检出；Ⅲ期和Ⅳ检出的CTC数目相对较多。与化学发光法检测常规肿瘤标记物(NSE/CEA/Cyfra21-1)作为早期诊断的结果相比，在65例肿瘤患者样本中，传统肿瘤标记物的检出为34例，检出率52.3%，CTC检测的检出为57例，检出率为87.7%，两者相比P<0.01；中晚期(Ⅲ-Ⅳ期)的CTC检出数量与早期(Ⅰ-Ⅱ期)相比，P<0.01，具有统计学差异(表2和图2)。

表2 微流控平台与常规肿瘤标志物检测结果汇总

图2 不同TNM分期患者样本CTCs检出细胞数统计图，CTCs(Ⅲ-Ⅳ)显著高于CTCs(Ⅰ-Ⅱ)，P<0.01

3 讨论

研究表明，循环肿瘤细胞与多种恶性肿瘤的临床病理分期及预后密切相关，其在远处转移和复发中的作用也日益受到关注[4]。由于外周血循环肿瘤细胞水平极低 ，这使得富集分离循环肿瘤细胞挑战巨大。 目前，包括基于细胞物理学特性的方法、基于磁性亲和选择的分选方法和基于微流体的生物学的分选方法在内，各种循环肿瘤细胞检测技术发展迅速，但大多处于研发阶段，从技术平台和临床应用角度仍有巨大发展空间。微流控技术是近些年在循环肿瘤细胞检测领域新兴的重要技术平台，其利用不同方法的捕获效率基本在70%以上[5,6]。本研究选取了一种具有高效、不依赖肿瘤细胞表面标志物特点的基于微流控平台的循环肿瘤细胞分选仪器，其原理是基于尺寸大小不同的细胞在微流控芯片中表现出力学特征的不同，从而通过惯性迁移达到分离的效果[7，8]。从掺入肿瘤细胞的健康人血样模拟肿瘤患者血样的试验结果来看，微流控平台具有较高的循环肿瘤细胞捕获效率(85.0±1.5)%，优于一些研究报道的肿瘤细胞捕获效率[9]。例如：应用纳米多孔碳酸酯膜的亲和性分选法对于PC-3细胞混于白细胞的捕获效率为70%[10]。采用金电极、PDMS微管道的双相电泳分选法对混于血液的MCF-7细胞的捕获效率为75%左右[11]。值得一提的是，该试验是在血液量较少的情况下完成(5 ml)，而利用密度梯度离心法分类CTCs需要15-30 ml的血量，阳性富集法的Cellsearch系统需要7.5 ml的血量[12]。这提示该方法在血液数量不多的情况也能检测，比一些CTCs检测具有优势。

NSCLC近年来发病率不断增高，目前在全球范围内NSCLC的发病率和死亡率居于首位。我国虽然包括手术治疗、药物治疗、放射治疗等在内的各种治疗手段已经取得巨大进步，但预后不良率较高且5年生存率与发达国家相比仍有巨大差距，肿瘤导致患者死亡的主要原因是由肿瘤的转移和复发引起的，而循环肿瘤细胞出现在恶性肿瘤患者外周血中是发生转移的必要条件[13，14]。本研究进一步通过对NSCLC患者术前血样进行了CTC检测，并与临床常用的肿瘤标记物(/NSE/CEA/Cyfra21-1)检测结果进行对比。结果显示，晚期(Ⅲ-Ⅳ期)肿瘤患者CTC检出数量显著高于早期患者(Ⅰ-Ⅱ)，而CTC阳性检出率和常规肿瘤标记物检出率相比具有显著的升高。本研究的不足之处在于没有进行一定样本数量的健康人群基线研究，入组的样本数量有限。虽然微流控平台还处于发展的早期阶段，但其在临床诊断分析上已显示出敏感度高、需要样本量少、效率高等优势。随着技术的不断完善，微流控技术有望在CTC检测研究中发挥更重要的作用。