抑郁诱导过程中腹腔注射CORM－2大鼠的抑郁症状、海马神经元活性、脑组织炎性因子基因表达观察

李晓云，孙静，张军玲

(益都中心医院，潍坊261000)

抑郁症是临床常见的精神类疾病，主要临床特征为情绪低落，常伴有思维及行为方面的改变［1]。近年抑郁症发病率逐年升高，已成为自杀的主要原因［2]。目前，抑郁症的发生机制尚未完全清楚，30%～40%患者在多种抗抑郁药物联合治疗下临床症状仍未缓解［3]。研究［4]发现，长期的慢性应激在抑郁症的发生发展中发挥重要作用。另有研究［5]认为，神经炎症反应与抑郁症的进展密切相关。一氧化碳(CO)是一种重要的气体信号分子，在调控血管张力、细胞生长、抗凋亡、抗炎中发挥关键性作用［6]。CO是否能改善抑郁症患者的抑郁症状?目前相关报道较少。为此我们通过慢性应激对大鼠进行大鼠抑郁诱导，观察抑郁诱导过程中腹腔注射CORM－2诱导大鼠的抑郁症状、海马神经元活性剂脑组织炎性因子白细胞介素1β(IL－1β)、IL－6、IL－8、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)的表达变化，并探讨其可能作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF级健康雄性SD大鼠48只，购自山东众山生物科技有限公司［动物质量合格证号：SCXK(鲁)2012－0004]，体质量(200±20)g，饲养于标准条件下，自由饮水和进食。CORM－2购自美国Sigma公司，总RNA提取试剂盒(Trizol法)购自美国Invitrogen公司，逆转录和PCR试剂盒购自大连宝生物公司，白细胞介素－1β(IL－1β)、IL－6、IL－8、肿瘤坏死因子 －α(TNF－α)及内参引物均由上海生工生物公司设计合成，尼氏染色液购自北京雷根公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio－Rad公司。

1.2 大鼠分组、抑郁诱导及CORM－2注射方法取48只大鼠，随机分为CO干预组、生理盐水组、诱导组、正常组，每组12只。CO干预组、生理盐水组、诱导组对大鼠进行抑郁诱导：将大鼠单只单笼饲养，每天被迫进行禁食、45°笼倾斜、冰水游泳、束缚活动、45℃热水游泳、昼夜倒置、湿笼等刺激中的1～2种，第2天选择另外两种刺激，以免相同刺激连续出现，防止大鼠能见刺激的发生，连续刺激21 d。CO干预组在诱导前1天腹腔注射CORM－2 10 mg/kg，后每7天腹腔注射1次，至诱导第21天共注射3次。生理盐水组在诱导前1天腹腔注射等量生理盐水，7 d/次，共注射3次。正常组大鼠饲养于正常标准条件下不作任何处理。诱导后正常组12只、诱导组9只、生理盐水组10只、CO干预组11只。

1.3 各组大鼠抑郁症状观察

1.3.1 各组大鼠体质量、食量和饮水量观察 分别于诱导前、诱导第21天，于清晨8∶00取各组大鼠进行称重，记录各组大鼠体质量、食量和饮水量。

1.3.2 各组大鼠行为能力观察 ①采用糖水偏好实验评估各组大鼠快感缺失程度诱导第21天取各组大鼠，检测前所有大鼠禁饮禁食20 h，于夜间8∶00～10∶00时将大鼠单笼置于无光照环境中，分别给予提前称重的正常饮用水和1%蔗糖水，自由饮用，30 min时将两瓶水位置颠倒，60 min后对两瓶水再次称重，测算各组大鼠糖水偏好率。糖水偏好率=1%蔗糖水饮用量/(1%蔗糖水饮用量+正常饮用水饮用量)×100%［7]。②旷场实验诱导第21天取各组大鼠，取无盖黑底方木箱(100 cm×100 cm×50 cm)，将箱底刷宽约3 mm白线纵横各3条，形成等大的16个方格，将大鼠朝墙方向放入4个拐角方格之一，让其自由活动3 min。分别记录跨越格数(水平活动)和后肢站立次数(垂直活动)［8]。

1.4 各组大鼠海马组织CA1区神经元活力观察诱导第21天时在进行完行为学检测后，各组随机选取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，断头取脑组织，快速置于－20℃冰箱中15 min，取出后行冠状位冰冻切片，厚度约2 mm，根据试剂盒说明进行尼氏染色，于高倍显微镜下观察各组大鼠海马组织神经元形态，取大鼠海马CA1区染色图像，利用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测算大鼠海马CA1区神经元存活率。海马CA1区神经元存活率=存活正常神经元数/总神经元数×100%。

1.5 各组大鼠脑组织炎症因子白细胞介素1β(IL－1β)、IL－6、IL－8、肿瘤坏死因子 α(TNF －α)mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。诱导第21天时取各组剩余大鼠，断头处死后留取脑组织(包括海马组织)，研磨后加入细胞裂解液，用总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，利用紫外分光光度计检测总RNA纯度，以A260/A280≥1.80作为合格标准完成后续实验。将总RNA逆转录为cDNA，以模板单链cDNA为模板进行PCR。PCR引物序列为 IL－1β上游引物5’－TGACCTGTTCTTTGAGGCTGAC－3’，下游引物 5’－CGAGATGCTGCTGTGAGATTTG－3’;IL－6上游引物 5’－GTACTCCAGAAGACCAGAGG－3’，下游引物 5’－TGCTGGTGACAACCACGGCC－3’;IL－8上游引物5’－TTGGCAGCCTTCCTGATTTC －3’，下游引物5’－TGGTCCACTCTCAATCACTCTCA－3’;TNF－α上游引物5’－TTGACCTCAGCGCTGAGTTG －3’，下游引物5’－CCTGTAGCCCACGTCGTAGC－3’;β－actin上游引物5’－TGCTGTGTTCCCATCTATCG－3’，下游引物5’－TTGGTGACAATACCGTGTTCA－3’。PCR反应条件：95℃ 3 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，73℃ 30 s，连续进行38次循环，每个样品均设3个平行反应复孔。以2－ΔΔCt代表各组大鼠脑组织IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA的相对表达量。重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以±s表示，同组大鼠干预前后比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD－t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、食量和饮水量比较 诱导前、诱导第21天各组大鼠体质量、食量和饮水量比较见表1。

表1 诱导前、诱导第21天各组大鼠体质量、食量和饮水量比较(±s)

表1 诱导前、诱导第21天各组大鼠体质量、食量和饮水量比较(±s)

注：与诱导前比较，aP＜0.05;与正常组比较，bP＜0.05;与诱导组比较，cP＜0.05;与生理盐水组比较，dP＜0.05。

组别 n 体质量(g) 食量(g) 饮水量(mL)CO干预组11诱导前 207.9 ±15.1 24.3 ±3.1 28.3 ±3.0诱导第21 天 310.7 ±16.6abcd 29.7 ±3.6abcd 36.1 ±3.6abcd诱导组 9诱导前 205.8 ±11.1 24.5 ±2.0 29.7 ±4.5诱导第21 天 237.1 ±14.9ab 19.9 ±4.1ab 25.2 ±2.3ab生理盐水组 10诱导前 209.0 ±14.0 24.8 ±3.7 31.8 ±4.0诱导第21 天 245.7 ±15.0ab 23.8 ±4.8ab 25.4 ±1.9ab正常组 12诱导前 207.1 ±14.7 23.8 ±3.4 30.3 ±4.8诱导第21 天 333.8 ±25.1a 34.5 ±4.5a 41.5 ±7.0a

2.2 各组大鼠糖水偏好率、水平活动及垂直活动情况比较 各组大鼠糖水偏好率、水平活动及垂直活动情况比较见表2。

2.3 各组大鼠海马组织CA1区神经元存活率比较正常组大鼠海马CA1区神经元胞膜完整、体积大、呈梭形，尼氏体丰富可见;诱导组和生理盐水组较正常组神经元细胞数量明显减少，受损细胞增多，胞质减少、胞核固缩、染色浅，尼氏体减少或消失;而CO干预组大鼠正常神经元细胞数较诱导组和生理盐水组显著增多，尼氏体增多。CO干预组、生理盐水组、诱导组及正常组大鼠海马组织CA1区神经元存活率分别为 61.7% ±9.0%、50.8% ±9.3%、50.4% ±8.2%、72.1% ±12.1%，与正常组比较，诱导组、生理盐水组和CO干预组海马组织CA1区神经元存活率降低(P均＜0.05)，与诱导组、生理盐水组比较，CO干预组海马组织CA1区神经元存活率升高(P均＜0.05)。

表2 各组大鼠糖水偏好率、水平活动及垂直活动情况比较(±s)

表2 各组大鼠糖水偏好率、水平活动及垂直活动情况比较(±s)

注：与正常组比较，bP＜0.05;与诱导组比较，cP＜0.05;与生理盐水组比较，dP＜0.05。

组别 n 糖水偏好率(%)水平活动(格数)垂直活动(次)CO 干预组 11 73.2 ± 7.4bcd 49.4 ± 7.4bcd10.2 ±4.2bcd生理盐水组 10 59.2 ± 8.3b 34.6 ± 7.0b 5.6 ±2.7b诱导组 9 60.2 ±13.9b 30.6 ± 6.3b 3.8 ±3.3b正常组12 92.1 ± 5.6 60.4 ±13.0 15.4 ±4.6

2.4 各组大鼠脑组织 IL －1β、IL －6、IL －8、TNF －α mRNA相对表达量比较 各组大鼠脑组织IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA相对表达量比较见表3。

表3 各组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较(±s)

表3 各组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较(±s)

注：与正常组比较，bP＜0.05;与诱导组比较，cP＜0.05;与生理盐水组比较，dP＜0.05。

组别 n IL－1β mRNA IL－6 mRNA IL－8 mRNATNF－αmRN 11 1.56 ±0.21 1.45 ±0.16 1.39 ±0.14 1.60 ±0.17生理盐水组 10 1.99 ±0.34 1.82 ±0.26 1.67 ±0.16 1.87 ±0.22诱导组 9 1.95 ±0.31 1.79 ±0.23 1.69 ±0.17 1.85 ±0.21正常组A CO干预组12 1.28 ±0.25 1.12 ±0.18 1.08 ±0.13 1.31 ±0.19

3 讨论

抑郁症作为严重威胁人类健康的精神疾病，给患者自身、家庭和社会带来严重危害。研究［9]发现，慢性应激在抑郁发生、进展中发挥重要作用，若个体长期接受不良应激，会导致基础代谢率升高、出现炎症反应，并伴免疫力降低、内分泌紊乱及情感行为异常等。因此，目前在研究抑郁时多基于此而制备不可预知应激刺激大鼠诱导，在一定程度上可模拟抑郁症患者发病过程和精神状态［10]。本研究利用温和、多变、不可预知的慢性刺激制备大鼠抑郁抑郁诱导，在刺激第21天时，与诱导前相比，诱导组大鼠体质量、食量和饮水量较建模前发生改变，且体质量、食量和饮水量均较正常组降低，同时，糖水偏好率、水平活动格数和垂直活动次数等行为学评价结果均出现异常，这些结果说明慢性应激可能引起了大鼠抑郁发生及进展，提示成功构建了大鼠抑郁诱导。

细胞因子假说作为抑郁发病机制的重要假说，认为细胞因子与抑郁发病关系密切，前炎性细胞因子如IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α 等参与了抑郁症的发病［11]。CO作为与一氧化氮类似的具有生物学活性的气体信号分子，在细胞生长、改善循环、抗凋亡、抗炎等过程中发挥重要重要［12]，可通过减少炎症反应而减少脓毒症所致的多器官损伤［13]。CORM－2作为CO携带者，在一定环境下能够可控性的释放CO而发挥生物学功能［14]。本研究利用腹腔注射CORM－2对抑郁诱导大鼠进行干预，结果显示，与诱导组和生理盐水组相比，CO干预组大鼠体质量、食量和饮水量均增加，糖水偏好率、水平活动格数和垂直活动次数等行为学均有所改善，说明外源性给予CO可减少抑郁诱导大鼠抑郁症状，脑组织病理学观察显示，CO干预组大鼠正常神经元细胞数较诱导组和生理盐水组显著增多，尼氏体增多，且神经元存活率增加，进一步说明外源性给予CO可减轻神经元损伤，促使尼氏体恢复，从而改善和保护脑功能。进一步对脑组织中炎症因子检测发现，与诱导组和生理盐水组相比，CO干预组大鼠脑组织中 IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA 相对表达量均降低，说明外源性给予CO可能通过减轻脑组织炎症反应而减轻抑郁症状，改善脑功能。我们推测，CORM－2具有抗抑郁作用，可能通过减少大鼠海马组织神经元损伤，降低脑组织IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA表达等途径改善抑郁诱导大鼠的抑郁症状。

有临床研究［15]发现，抑郁症患者外周血中TNF－a、IL－1、IL－6等细胞因子表达水平升高，动物实验中，外周或中枢给予细胞因子或炎症诱导剂也可引发动物抑郁样行为，且可被抗抑郁药物所阻断，而将细胞因子阻断则可产生抗抑郁作用［16]。本文实验结果进一步证实了抑郁症发病机制的细胞因子学说，同时间接外源性给予CO可抑制炎症因子释放，抗细胞因子治疗可能成为抗抑郁药物的机制之一，将有助于推进抗抑郁药物作用靶点研究，为抗抑郁治疗找到新的干预途径，目前仍然存在局限性，需继续大规模实验证实。

综上所述，抑郁诱导过程中腹腔注射CORM－2诱导大鼠的抑郁症状改善，海马组织CA1区神经元活力更高，脑组织炎性因子表达降低。CORM－2可通过减少大鼠海马组织神经元损伤，降低脑组织IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA 表达等途径改善抑郁诱导大鼠的抑郁症状。