茶叶中咖啡因和儿茶素类物质的提取及含量测定

邵建群 李青原 王玉记 张 枫

(首都医科大学药学院实验教学中心，北京 100069)

茶叶是人们日常喜欢的饮品之一，茶叶中含有多种天然活性物质。茶多酚是茶叶中的主要有效成分，占干质量的15%～30%，儿茶素类占其中的60%～80%[1]。主要包括表儿茶素(epicatechin，EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)。这些儿茶素类物质是茶叶的风味与保健因子，目前的研究表明，EC、ECG能够抑制前列腺间质细胞增生[2]，酯型儿茶素EGCG 和ECG，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种特性[3-6]。

咖啡因(caffeine，CAF)是茶叶的另一重要有效成分，含量占茶叶物质总量的2%～4%[7]。咖啡因具有兴奋中枢神经系统，促进新陈代谢、消除疲劳、增加心脏和胃肠道功能的作用。近年来研究显示可以预防阿尔茨海默病[8]、早产儿支气管肺炎[9]，适当饮用还可以降低肥胖、糖尿病和肿瘤的发病危险[10]。因此研究茶叶中咖啡因的含量，可以合理利用茶叶的保健功能。

针对茶叶中某些物质的提取有多种方法[11-12]，但能够对茶叶有效成分进行同时复合提取，也就是一次投料得到多种产品，这既可以提高效益，也是对茶叶资源的充分利用。目前国外采用超临界萃取技术[13]，我国在这方面的研究还有待加强。由于咖啡因、儿茶素类能溶解到乙醇中，本研究以乙醇为提取溶剂，高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)为检测手段，通过采用加热浸提法和超声波辅助浸提法，对茶叶中的CAF、EGCG、ECG、EC 4种有效成分进行了同时提取的工艺对比研究，旨在为茶叶多种有效成分的复合提取技术提供一些相应的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪( Alliance 2695/2498，美国Waters公司)；色谱柱(AcclaimTM120，美国Thermo scientific公司)；BT25S电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；RCTBS025控温磁力搅拌器(德国IKA公司)；高速离心机(日本久保田2420)；UV2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

1.1.2 试剂

标准对照品CAF购自美国Alfa Chemical公司 ；EGCG、ECG、EC购自大连美仑生物技术有限公司。甲醇(色谱纯，购自美国Fisher公司)，水为双蒸水。无水乙醇(分析纯)购自北京现代东方精细化学品有限公司；36%乙酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。实验所用茶叶均为北京市商品市售茶叶。

1.2 溶液的配制

1.2.1 对照品储备溶液

分别精密称取CAF 50 mg、EGCG 75 mg、ECG 50 mg、EC 15 mg标准对照品，置于50 mL容量瓶，加适量无水乙醇溶解后，稀释至刻度，摇匀后配制成CAF质量浓度为1 mg/mL、EGCG质量浓度为1.5 mg/mL、ECG质量浓度为1 mg/mL、EC质量浓度为300 μg/mL的储备液。

1.2.2 茶叶样品溶液

茶叶样品用研钵捣碎，准确称取茶叶样品加入到锥形瓶中，采用不同浓度的提取溶剂乙醇，控制不同的提取时间，不同料液比，分别进行加热和超声波辅助浸提法工艺进行提取。把提取所得的茶叶溶液用离心机以4 000 r/min离心10 min，取上清液经0.45 μm的微孔滤膜过滤，取滤液200 μL，加入流动相800 μL，作为样品溶液进行HPLC测定。

1.3 检测波长的选择

图1 标准对照品CAF、EGCG、ECG和EC的紫外光谱图Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of CAF,EGCG,ECG and EC standard substance

CAF：caffeine；EGCG：epigallocatechin gallate；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

1.4 色谱条件

色谱柱为C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)；流动相为甲醇∶双蒸水∶36%乙酸(25 mL∶74 mL∶1 mL)；流速为 1 mL/min；检测波长为280 nm，柱温为室温；进样体积为10 μL。

2 结果

2.1 HPLC适应性结果

精密吸取适量稀释的“1.2.1”项下CAF、EGCG、ECG和EC各对照品储备液和样品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按照“1.4”项下色谱条件进样测定，记录色谱图详见图2。EGCG、CAF、EC、ECG的保留时间分别为8.86、10.57、12.08、20.80 min，理论塔板数均大于8 000。样品溶液中EGCG、CAF、EC、ECG与相邻峰的分离度均大于1.5，对称因子均为1。

2.2 线性关系结果

精密吸取适量稀释的“1.2.1”项下CAF、EGCG、ECG和EC各系列对照品储备液，按照“1.4”项下色谱条件对各系列分别进样测定。以峰面积y为纵坐标，对照品质量浓度x为横坐标，进行线性回归，各组分回归方程及相关系数详见表1，结果表明该方法在该实验范围内线性关系良好。

2.3 加热浸提法

加热浸提法是传统的提取工艺，提取条件简单易行，为防止一些物质结构发生变化，提取温度不宜太高。

图2 4种EGCG、CAF、EC和ECG标准对照品和茶叶样品的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of EGCG，CAF，EC and ECG standard substance and tea sample

HPLC：high performance liquid chromatography；EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；EC：epicatechin；ECG：epicatechin gallate.

表1 CAF、EGCG、ECG和EC的线性关系Tab.1 Linearities of CAF、EGCG、ECG and EC

CAF：caffeine；EGCG：epigallocatechin gallate；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

由于CAF、EGCG、ECG 和EC都能溶于乙醇中，实验以乙醇溶液为提取溶剂，采用市售绿茶为样本，把所得提取液按照“1.2.2”以及“1.4”项下色谱条件进行处理和测定，通过单因素实验来考查乙醇的浓度、浸提时间、料液比不同对CAF、EGCG、ECG、EC提取率的影响。

2.3.1 乙醇浓度对提取率的影响

在1 g茶叶中，分别加入体积分数如图3所示的乙醇溶液各15 mL，控制水浴加热温度为85 ℃，在搅拌条件下提取30 min。由图3的提取率结果可知，乙醇浓度太高和太低，4种物质的提取率都不如乙醇体积分数在50%75%范围内的高。因此，选择最佳的乙醇提取体积分数为65%。

2.3.2 提取时间对提取率的影响

在1 g茶叶中，加入体积分数75%的乙醇溶液15 mL，控制水浴加热温度为85 ℃，在搅拌条件下分别按图4所示的时间长度进行提取。由图4的提取率结果可知，加热浸提时间从30 min开始，提取率缓慢下降。因此，实验选择30 min为最佳提取时间。

图3 不同乙醇浓度的提取率结果Fig.3 Different concentration of ethanol on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

图4 不同提取时间的提取率结果Fig.4 Different extraction time on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.3.3 料液比对提取率的影响

在1 g茶叶中，控制水浴加热温度为85 ℃，采用体积分数75%乙醇溶液提取，按照如图5所示的料液比(g∶mL)搅拌提取30 min，然后把离心得到的提取液定容到50 mL进行测定。由图5的提取率结果可知，但当料液比从1∶25增大到1∶50时，CAF、ECG、EC提取率增加相对缓慢。由于增大料液比，溶剂的用量大，后续对溶剂的处理工作量也大。因此，实验选择1∶25为较佳的加热浸提料液比。

图5 不同料液比的提取率结果Fig.5 Different ratio of material to solution on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.4 超声波浸提法

超声波提取是利用超声波机械粉碎和空化作用，加速提取物从茶叶向溶剂扩散的速度，增加有效成分的提取率，可避免加热造成如儿茶素类物质的氧化。实验以乙醇为提取溶剂，采用市售绿茶为样本，在室温条件下，以超声功率为250 W进行提取。把所得提取液按照“1.2.2”以及“1.4”项下色谱条件进行处理和测定，通过单因素实验考查乙醇的体积分数、超声时间、料液比不同对CAF、EGCG、ECG、EC提取率的影响。

2.4.1 乙醇浓度对提取率的影响

在1 g茶叶中，分别加入体积分数如图6所示的乙醇溶液各15 mL，室温下超声提取60 min。由图6的提取率结果可知，乙醇体积分数在50%75%范围内各物质的提取率较高。但当乙醇体积分数大于85%时，提取率开始显著降低。故实验选择乙醇的提取体积分数为65%。

图6 不同乙醇浓度的提取率结果Fig.6 Different concentration of ethanol on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.4.2 超声时间对提取率的影响

在1 g茶叶中，加入体积分数50%的乙醇溶液15 mL，室温下按如图7所示的时间长度进行超声提取。由图7的提取率结果可知，超声时间从10 min到60 min，提取率是逐渐增加，但到70 min时有所下降。因此，实验选择60 min为最佳超声浸提时间。

2.4.3 料液比对提取率的影响

在1 g茶叶中，采用体积分数50%乙醇溶液提取，按照如图8所示的各料液比室温下超声提取60 min，然后把提取液定容到50 mL进行测定。由图8提取率结果可知，随着料液比的增加，提取率会提高。当料液比从1∶25加大到1∶50时，CAF、ECG、EC提取率增加缓慢。因此，实验选择1∶25为较佳的超声浸提料液比。

图7 不同提取时间的提取率结果Fig.7 Different extraction time on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

图8 不同料液比的提取率结果Fig.8 Different ratio of material to solution on extraction ratio results

EGCG：epigallocatechin gallate；CAF：caffeine；ECG：epicatechin gallate；EC：epicatechin.

2.5 两种提取工艺的对比

分别采用筛选出的加热浸提工艺，即乙醇体积分数为65%、料液比为1∶25、85 ℃加热搅拌30 min提取；室温超声波浸提工艺，即乙醇体积分数为65%，料液比为 1∶25、超声60 min，对市售的8种茶叶中的4种有效成分进行复合提取。由表2的数据结果可知：两种提取工艺对同一种茶叶的4种有效成分的提取率数据结果相近，这说明两种工艺的提取效率相当。另外，在实验所研究的8种茶叶中EGCG、ECG 和EC在红茶和普洱茶里含量较少。

3 讨论

3.1 提取工艺条件的选择

茶叶中含有多种有效成分，本实验是研究不同提取工艺，同时复合提取CAF、EGCG、ECG、EC 这4种有效成分。从加热和超声提取工艺来看，较高的浸出率是乙醇提取浓度在50%75%范围内。推断是因为几种物质在乙醇和水中都有一定的溶解度，但由于它们结构中含有亲水和疏水基团，所以纯粹用水或用乙醇做提取溶剂都不能达到它们最大的浸出度，而一定比例的醇、水混合是最合适的提取剂，所以实验选定了65%的乙醇为提取浓度。

表2 8种茶叶样品中CAF、EGCG、ECG 和EC的测定结果Tab.2 Determination results of eight kinds of tea sample on CAF, EGCG, ECG and EC

加热提取是基于物质在加热情况下溶解度会增大，但加热温度不宜太高，提取时间也不能太长，否则会破坏被提取物质的结构。而室温下超声提取对分子结构中一些易氧化的基团影响最小。85 ℃加热提取30 min与室温超声60 min的提取效率相当。

在料液比研究中，提取溶剂用量加大，对物质的提取率会提高。但如果溶剂用量无限增大，提取率不会大幅度增加时，加大溶剂的用量，既增加了成本，也带来了溶剂回收处理的问题，因而实验选择料液比为 1∶25。

3.2 茶叶品种对有效成分的影响

茶叶中表儿茶素EC含量最高，其次依次是EGCG、CAF和ECG。对于儿茶素类EGCG、ECG、EC，在绿茶和花茶中的含量最高，其次是铁观音茶叶，含量较低的是红茶、普洱茶。这可能是由于红茶、普洱茶是发酵茶叶[14]，铁观音则属于半发酵茶叶，绿茶由于没有经过发酵，EGCG、ECG、EC结构中易氧化的-OH基团没有被破坏，所以含量高。而CAF在几种类型的茶叶中都有相当的含量，这说明咖啡因不受是否发酵的影响，分子结构相对稳定，由此可知，如果药用工业上大量提取儿茶素类物质，就应从未发酵过的茶叶中提取。

中国是茶的故乡，并且具有多种茶叶品种，从茶叶中提取到的物质具有广泛的生物活性[15-16]，同时它们在食品、保健品、化妆品等领域也有广泛的应用[17-18]。本实验所进行的这些活性成分的复合提取研究，旨在提高茶叶的最大利用率，降低成本，减少污染及废弃物，以实现较高的社会和经济效益，从而促进人类的身体健康。

致谢：本论文获得“基础与专业药学国家级实验教学示范中心(首都医科大学)”和“医学化学与药学北京高等学校示范性校内创新实践基地(首都医科大学)”两大平台的支持。