新疆准噶尔盆地蜱种调查及DNA条形码应用

姜蒙蒙，杨梅花，王远志，赵姗姗，谭文波，陈创夫，盛金良*

(1 石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2 石河子大学农学院，新疆 石河子 832000；3 石河子大学医学院，新疆 石河子 832000)

迄今研究表明，地球上已知的生物物种约150万种[1]，其中，全世界已知的蜱类有914种[2]。传统的蜱种分类主要依赖于形态学分类。形态学分类具有快速、简便的特点。同时，形态学分类也有许多缺陷，比如：1)相似蜱种易与混淆，如草原革蜱和森林革蜱；2)未成熟蜱不能通过形态学进行有效区分；3)形态学方法几乎不能用于饱血蜱的鉴定。近年，随着分子生物学的快速发展，以核酸作为物种鉴定靶标日益被分类学家推崇。DNA条形码是一种新型的生物学技术，主要通过较短的DNA序列，在物种水平上对现存物种和未知物种进行识别和鉴定[3-4]，为人们了解和探索生物领域提供了新的理念。DNA条形码的研究方法与传统的分类系统学研究有一定的相似性，但前者更具快速、自动以及通用等特性，可以在缺乏形态分类学经验的时候，能提供物种识别功能；此外，能够结合传统形态学进行深入的生物学研究。生物DNA条形码的兴起，为经典学科的发展提供了机遇[5-6]。

DNA条形码技术为蜱种鉴定提供了一个强而有效的工具，快速推进了蜱种鉴定标准化的进程。2016年，Ondrejicka D A等[7]利用DNA条形码技术基于线粒体COI基因对加拿大26个蜱种进行了分子快速鉴定，该方法不仅支持了形态学鉴定方法，并提出：在鼩鼱硬蜱和德克萨斯硬蜱存在种内遗传多样性。2012年，Gariepy T D等应用DNA条形码文库对饱血蜱进行快速鉴定，获得良好效果[8]。新疆广袤的地域、独特的地理景观、丰富的宿主资源为蜱种的生物多样性提供了“良好生境”。新疆已经发现的蜱种就多达40余种[9]。而新疆准噶尔盆地地处北疆，人口及牲畜分布密集，与蜱虫在生活空间上存在很大的重叠，因此，掌握动物体表寄生蜱的种类并选择通用性强的DNA条形码片段，对开展自然疫源性疾病的研究提供指导。本研究通过对新疆准噶尔盆地捕获的蜱，选择线粒体COI基因序列进行比对分析，进一步验证COI基因作为蜱DNA条形码在蜱种鉴定中的有效性。

1 材料与方法

1.1 蜱的采集

2017、2018年每年4～6月在新疆北疆准噶尔盆地地区(乌苏县、精河县、福海县、布尔津县、吉木乃县、富蕴县、石河子市以及奎屯市)8个县、市采集4880只蜱虫。蜱种采集是采用布旗法和动物体表直接采集法[10]。

1.2 标本处理

本次采集的蜱经双蒸水清洗至蜱表面没有残留污垢，保存于5%甘油的70%乙醇中备用。

1.3 蜱形态学鉴定分析

用普通光学显微镜对采集到的蜱进行形态学观察，依照参考文献[9-11]使用体视解剖显微镜(LEICA M165 C)进行蜱虫图像的采集。

1.4 蜱虫DNA提取、PCR扩增、测序以及DNA条形码上传

按DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书，提取蜱的基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。依据参考文献引物[12]，进行蜱线粒体COI基因部分序列进行扩增(COI: F-5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′，R-5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′)。PCR产物送北京华大生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定，测序结果通过在GenBank中进行BLAST分析后，将差异序列登录至GenBank，并且将序列的详细信息：1)物种信息，如名称、性别、生长阶段和繁殖过程、分类地位。2)凭证标本信息。3)采集信息。4)标本鉴定人。5)DNA条形码序列。6)序列峰图。上传至DNA条形码库(http://www.boldsystems.org/)。

1.5 COI序列分析方法

利用DNAMAN软件对序列进行比对辅以手工校正，并用邻近法(NJ)构建系统发生树。系统树分支的置信度均采用自展法1 000次重复验证。

2 结果与分析

2.1 蜱种鉴定及分布情况

蜱种鉴定及分布情况见表1、图1。

图1 新疆准噶尔盆地各县市蜱虫采集数量丰度Fig.1 Abundance of ticks in different counties (cities) in Junggar Basin, Xinjiang

分布带采样点宿主蜱种数量准噶尔盆地西南边缘精河长尾黄鼠凯瑟硬蜱12森林革蜱137准噶尔盆地的东北部富蕴马边缘革蜱128准噶尔盆地北缘福海骆驼亚洲璃眼蜱273南跨准噶尔盆地乌苏山脉及草被森林革蜱554准噶尔盆地西南部奎屯沙漠边缘亚洲璃眼蜱83准噶尔盆地南部石河子羊亚洲璃眼蜱245准噶尔盆地北沿布尔津骆驼亚洲璃眼蜱1230准葛尔盆地北缘吉木乃羊森林革蜱草原革蜱2218

在新疆准噶尔盆地部分县市8个采集点共采集到家畜寄生蜱4243只和游离蜱637只，经形态学与分子学鉴定结果隶属1科3属5种，分别是边缘革蜱(D.marginatus)、森林革蜱(D.silvarum)、草原革蜱(D.nuttalli)；亚洲璃眼蜱(H.asiaticum)；凯瑟硬蜱(I.kaiseri)(表1)。本研究中不同地区不同采样点的蜱样本中以奎屯市样本数最少，占比1.7%(83/4880)，以吉木乃县样本数最多，占比45%(2218/4880)(图1)。

2.2 不同蜱COI基因PCR扩增结果

琼脂糖凝胶检测结果显示，COI的PCR产物约为650 bp的DNA片段，与预期目的片段大小一致(图2)。

注：M2∶1 200 bp DNA Maker；—：阴性对照；1-2：亚洲璃眼蜱；3-4：边缘革蜱；5-6：草原革蜱；7-8：森林革蜱；9-10：凯瑟硬蜱图2 部分蜱线粒体COI基因PCR结果Fig.2 Mitochondrial COI gene fragments of ticks were amplified with PCR

2.3 核酸序列分析

基于COI基因进化表明同1种蜱种在不同地理环境中存在基因差异，例如，采自于新疆吉木乃株、福海株以及中国黑龙江株(登录号：KT764942)的草原革蜱存在有3～4个碱基的差异，采自于富蕴县的边缘革蜱与罗马尼亚株(登录号：FN394328)存在11个碱基的差异，凯瑟硬蜱的新疆株与罗马尼亚株、匈牙利株、德国株以及塞尔维亚株(登录号：KY962026，KY962014，KY962042和KY962033)存在8-10个碱基的差异。

2.4 进化树分析

进化树分析见图3。

1)革蜱属聚类在同一分支，其中，来源于乌苏、精河的森林革蜱相似性很高并聚为一支，边缘革蜱富蕴株与新疆的阿拉山口株(登录号：KU880588)聚为一支。2)在本研究中亚洲璃眼蜱与内蒙古株(登录号：JX051148)以及土库曼斯坦株(登录号：KU130586)聚类为姐妹分支。3)在本研究中发现的亚洲新现蜱种凯瑟硬蜱精河株(登录号：MH279561)与部分欧洲国家(登录号：KY962025、KY962042/KY962043、KY962033、KY962014)聚为一支。表明在不同地理生境中同一蜱种会根据环境等因素产生基因上的进化或者突变。进一步表明COI作为蜱种鉴定的基因工具通用性较强。

注：◆代表本研究部分蜱虫测序结果图3 基于COI基因序列对代表性蜱种进行系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic of representative tick specimens inferred from COI gene

本实验中基于COI基因测序所获取的部分蜱虫序列已上传至GeneBank，登录号为MK307807、MH079424、MH279561、MK610451-MK610453和MK213071-MK213075。

3 讨论

在本次研究中，从新疆准噶尔盆地采集到的亚洲璃眼蜱、森林革蜱、草原革蜱以及边缘革蜱与前期王远志等人调查的新疆优势蜱种结果基本一致。与之前报道不同的是，本次研究更侧重于新疆人群、畜群以及昆虫等更加丰富的新疆内部县市地区，我们选择在不同的地理生境来获取蜱虫信息，调查其分布的密集程度。然而，经研究发现，一些外来种或入侵种会因新环境的气候、地理生境等生活环境的差异发生基因上的突变或者进化，极易造成蜱种鉴定错误的现象。因此，应用一个快速高效的DNA条形码片段对于蜱种鉴定必不可少。

2003年, 加拿大科学家Paul Hebert等发表了第一批有关生物DNA条形码的研究结果, 首次提出应用COI基因片段作为动物类群的DNA条形码的理念[13]。在此之后，COI作为条形码识别片段广泛运用于飞禽、陆生动物和海洋小型底栖动物鉴定等[14-17]。它不仅可以鉴定出不同类群，还能区分开近缘类群, 构建不同分类阶元的系统发育关系。因此COI已被公认为动物DNA标准条形码片段而得到广泛应用。据统计，世界上蜱种分类将蜱归类为3科18属914种。到目前为止，中国已描述定名蜱类有2科10属122种[18-20]。新疆占中国国土面积的1/6，生态地理环境多样，蜱虫生活的生境也更加复杂。前期报道显示，塔里木盆地有5属10种[21]，准噶尔盆地有5属21种[22]。2011-2018年，王远志等对新疆北疆14个县、市采集的5257只蜱研究显示：共检测到7种蜱，其中亚洲璃眼蜱、刻点血蜱、草原革蜱和边缘革蜱为优势蜱种[23]。本研究主要对新疆准噶尔盆地部分县市的蜱虫中一些形态近似种和潜在危险物种进行区分，辨认各濒危物种、土著种和入侵种。

随着科学技术的飞速发展，DNA条形码的发展有效弥补了蜱种传统分类学在分类鉴定方面的不足，比如个体差异、环境影响导致蜱形态学鉴定具有很大的局限性。DNA条形码是基于DNA片段对每种物种便于识别的特有手段，有效减少其他因素所产生的误差，且不受蜱的形态特征、基因突变及地理生境不同等诸多限制的影响，不仅可以做为蜱传统分类学的辅助措施，补充蜱形态描述上的不足，同时又能快速发现新种或隐存种，加快物种识别速度及准确性。

本次调查显示：基于COI基因进化表明同一种蜱种在不同地理环境中存在基因差异，种内遗传距离在0.8%～1.1%之间，种间遗传距离5%～11%，不同科属间遗传距离大多在12%～23%之间，种间遗传距离显著大于种内遗传距离。因此，在本研究中，COI作为鉴定蜱种的DNA条形码十分具有代表性。这可能是源于不同蜱虫在不同的生境中为了适应环境条件发生了某些基因突变或者进化。根据先前的报道结合新疆独特的地理环境，本研究认为地理环境的不同占据主要因素[24]。新疆是重要的贸易枢纽，通过牲畜的交易进行也有引进或者输出外源种或内源种。因此，选择适宜的DNA条形码对于今后的蜱传病原的筛查与防控具有重要意义，线粒体COI基因作为DNA条形码用于蜱种类鉴别具有一定的可行性，利用DNA条形码检测技术是准确鉴定物种的趋势之一。