电针对创伤性脊髓损伤大鼠下肢骨骼肌萎缩相关蛋白表达的影响

范蕊 ，吴宗辉，陈晓琳，邹佐强，龙在云，姚兰，李斌

1.西南大学医院，重庆市 400715；2.西南大学运动康复研究所，重庆市 400715；3.陆军军医大学大坪医院野战外科研究所第三研究室，创伤与烧伤国家重点实验室，重庆市 400042

创伤性脊髓损伤(traumatic spinal cord injury,TSCI)有较高发病率和死亡率[1]。国内一项Meta 分析指出[2]，我国TSCI年患病率为37人次/100万，多发于中青年人群，提示我国TSCI疾病负担严重。交通事故、高空坠落、跌倒和创伤为主要TSCI的致伤原因[3]。长期的废用和失神经支配以及脊髓缓慢的修复过程，均使下肢肌肉发生严重萎缩，从而影响患者生活质量和日常行为活动，给患者和社会造成较大负担。研究表明[4‑7]，多种信号通路可通过调控肌纤维类型的转化、肌卫星细胞增殖分化功能的改变、蛋白降解及合成的失衡等机制，介导脊髓损伤后下肢骨骼肌萎缩。

针灸对于延缓脊髓损伤后肌肉萎缩的疗效显著[8‑10]。但目前基础研究大多从促进脊髓修复方面探寻针灸对脊髓损伤的作用机制[11‑12]，而电针对延缓脊髓损伤后靶肌肉萎缩的研究尚不深入。本研究通过电针干预TSCI大鼠，观察腓肠肌中肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)、肌肉特异性环指蛋白1 (muscle‑specific ring finger protein 1,MuRF1，由Trim63基因编码)、肌肉萎缩盒F蛋白32(F‑box only protein 32,Atro‑gin‑1，由Fbxo32 基因编码)、成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,Myod)和肌细胞生成素(myo‑genin,Myog)的表达变化，探讨电针干预延缓TSCI相关肌萎缩的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级健康成年雌性Sprague‑Dawley 大鼠45 只，体质量(200±20) g，由陆军军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(渝)2012‑0005。大鼠分笼饲养，室温(23±2)℃，相对湿度(50±10)%，明暗12 h 交替，饮食水自由摄取。适应性喂养1 周后，按随机数字表法分为假手术组(n=12)和造模组(n=33)。实验过程中动物处置均符合陆军军医大学动物实验伦理委员会标准。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol 总RNA 提取液、RR037A 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod、Myog、β‑Actin 引物合成：日本TAKARA 公司。水合氯醛、苏木素‑伊红(Hematoxylin‑Eosin,HE)染液试剂盒：中国索莱宝公司。汉医牌无菌针灸针：北京汉医医疗器械中心。SDZ‑II型电子针治疗仪：苏州医疗用品有限公司。柔软型实验大鼠固定器：温州原上草医疗科技有限公司。精密电子天平：美国SE‑TRA 公司。全能台式通用高速冷冻离心机：德国HERAEUS 公司。实时定量聚合酶链反应(real‑time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)仪：美国APPLIED BIOSYSTEMS 公司。正置显微镜和照相系统：OLYMPUS 公司。Image‑Pro Plus 6.0(IPP 6.0)图像分析软件。

1.3 动物模型制备

通过重物打击方法制备大鼠TSCI模型[13]。所有大鼠予4%水合氯醛溶液10 mg/kg 腹腔注射麻醉后常规备皮，俯卧位固定，以T9棘突为中心做一个长约2～3 cm的纵向切口，剥离筋膜切开椎板后暴露T9节段胸髓。造模组采用Allen 法将10 g 打击棒从2.5 cm 高度自由落下，撞击并损伤T9胸髓。假手术组仅暴露T9胸髓，不予以撞击损伤，之后逐层缝合伤口。打击后损伤处脊髓出现出血肿胀，致伤瞬间尾部会痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动后，出现双下肢瘫痪即为造模成功。术后假手术组全部存活，而造模组成功存活24 只，按照随机数字表法随机分为模型组(n=12)和电针组(n=12)。

1.4 电针刺激方法及参数选择

造模后1 d，电针组予以电针干预，将大鼠固定于柔软型实验大鼠固定器[14]，参照并改进吕威等[15]针刺方法，用直径0.25 mm、长13 mm 的一次性无菌针灸针电针大椎、命门和双侧足三里穴干预，进针5～7 mm。干预参数2.0 Hz，1.0 mA，连续波，每次10 min，每天1次，每周6次，连续干预28 d。

假手术组和模型组每天予以相同方法固定，但不予电针干预。

1.5 BBB(Basso‑Beattie‑Bresnahan)评分

术前，术后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d，对每组进行BBB 行为学评分。每只大鼠每次观察5 min，共观测3次，以3次平均值作为最终结果。0分表示完全性截瘫，21分表示正常。为尽量避免主观因素影响评分结果，BBB评分的实际操作均通过双人、单盲方法进行。同时，为避免因膀胱充盈而影响大鼠行为，每只大鼠在进行BBB评分前需确认排空膀胱。

1.6 腓肠肌湿重比

术前和术后28 d 针刺干预结束后，将大鼠置于电子天平上称取体质量。大鼠腹腔注射4%水合氯醛10 mg/kg 麻醉，快速并完整剥离双侧腓肠肌，吸干其表面残留液体，电子天平称取肌湿重。计算双侧腓肠肌湿重比。

1.7 腓肠肌纤维横截面积和直径

腓肠肌离体后，一部分组织置于4%多聚甲醛中固定2 d，后经梯度酒精脱水、浸蜡、包埋后制备石蜡切片并进行HE 染色。每组选取左、右侧各12 张切片置于200 倍光学显微镜下观察，每张切片随机选取5 个视野拍照，每个视野随机选取5 个细胞，经IPP 6.0 图像分析软件计算各组大鼠腓肠肌纤维横截面积和直径。

1.8 qPCR

取各组冰冻保存的腓肠肌样本约50 mg，用Trizol法提取总RNA；检测总RNA 浓度及纯度后分别按RR037A 逆转录试剂盒操作步骤配置反应体系，置于T100™PCR 仪中进行逆转录反应，按照SYBR Green法 配制Mix 反应 体系25 μl (SYBR 12.5 μl；前引 物1 μl；后引物1 μl；cDNA 溶液2 μl；DEPC 水8.5 μl)后上机进行qPCR 反应并读取Ct 值。以Folds=2‑ΔΔCt表示模型组、电针组和假手术组目的基因表达的倍比关系，计算公式如下：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ‑Actin)模型组/电针组-(Ct目的基因-Ctβ‑Actin)假手术组，重复12 次，计算平均值。上下游引物序列见表1。

表1 引物序列

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料采用(xˉ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用Bonferroni 检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

术前各组BBB 评分均＞20 分，且无显著性差异(P ＞0.05)。术后3 d、7 d、14 d、21 d 和28 d，模型组BBB 评分明显低于假手术组(P ＜0.01)，术后7 d、14 d、21 d 和28 d，电针组BBB 评分明显高于模型组(P ＜0.01)。见表2。

2.2 腓肠肌湿重比

术前各组体质量无显著性差异(P ＞0.05)。术后28 d，模型组体质量明显低于假手术组(P ＜0.01)；模型组左、右侧腓肠肌湿重和腓肠肌湿重比均明显低于假手术组(P ＜0.01)；电针组左、右侧腓肠肌湿重和腓肠肌湿重比均明显高于模型组(P ＜0.01)。见表3。

2.3 腓肠肌形态学

与假手术组相比，模型组、电针组腓肠肌纤维变小，电针组略大于模型组。见图1。术后28 d 后，与假手术组比较，模型组双下肢腓肠肌纤维横截面积和直径明显减小(P ＜0.01)；电针组双下肢腓肠肌纤维截面积和直径大于模型组(P ＜0.05)。见表4。

表2 各组术后各时间点BBB评分

表3 各组手术前后体质量及术后28 d腓肠肌湿重和肌湿重比

图1 各组术后28 d腓肠肌形态学比较(HE染色，×200)

表4 各组术后28 d双侧腓肠肌纤维横截面积和直径

2.4 腓肠肌中MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod 和Myog mRNA相对表达量

术后28 d，与假手术组比较，模型组腓肠肌中MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod 和Myog mRNA 表达增加(P ＜0.05)，电针组MSTN、Trim63 和Fbxo32 mRNA 表达均低于模型组(P ＜0.05)，Myod 和Myog mRNA表达高于模型组(P ＜0.05)。见表5。

3 讨论

脊髓损伤后，下肢肌肉由于长期处于失神经支配和废用状态而发生严重肌萎缩。本实验通过重物打击大鼠T9胸髓制备TSCI模型，观察电针干预对TSCI大鼠双下肢腓肠肌萎缩的延缓作用，并探讨其可能机制。目前基础研究中，多数以BBB 评分为指标衡量TSCI大鼠下肢运动功能[13,16]，以下肢肌肉的肌湿重比、肌纤维横截面积和直径[17]为指标衡量肌肉萎缩程度。TSCI模型制备成功后，上述肌肉相关指标均有不同程度的下降。本实验结果表明，电针干预大椎、命门和双侧足三里穴不仅能有效提高BBB评分，改善大鼠下肢功能活动，还能有效延缓TSCI大鼠双侧腓肠肌湿重比及肌纤维横截面积和直径的下降，与前期研究结果[18‑19]相似，提示电针干预能有效延缓TSCI诱导的双下肢肌萎缩。

脊髓解剖与中医学的督脉基本一致，脊髓损伤所致的下肢瘫痪和肌肉萎缩等症状属于中医学中的“体惰”“痿证”范畴。《灵枢·寒热篇》指出[20]：“若有所堕坠，四肢懈惰不收，名曰：体惰”。临床多主张通督脉而壮阳气，治疗以活血化瘀、祛瘀通督、益气通络为主[21]。命门为督脉要穴，具有培元固本、强健腰膝的功能。大椎为手足三阳、督脉之会，具有和解少阳以驱邪外出的功能，足三里为足阳明胃经合穴，具有强健筋骨、舒筋活血、补中益气等功能。现代研究表明[22]，督脉电针干预能通过增加大鼠脊髓损伤局部脑源性神经营养因子和神经营养蛋白3 的表达，促进神经修复和下肢功能康复。本研究通过电针干预大鼠命门、大椎和双侧足三里穴，共奏疏通督脉、温肾壮阳、益气化瘀的功效，延缓TSCI大鼠下肢肌肉萎缩。

表5 术后28 d各组腓肠肌中MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod和Myog mRNA相对表达量

脊髓损伤所致下肢肌肉萎缩的相关机制复杂。MSTN 被认为在这一过程中发挥着重要作用。MSTN是转化生长因子β (transforming growth factor‑β,TGF‑β)超家族的成员。作为强有力的骨骼肌负向调控因子，MSTN 具有抑制肌蛋白的合成、促进肌蛋白降解和抑制骨骼肌卫星细胞增殖分化的功能[23‑24]。上述功能的实现主要通过其下游信号通路Smads 蛋白介导完成。多数研究表明[25]，脊髓损伤后下肢骨骼肌中MSTN 的表达增加，磷酸化的Smad2/3 在胞内与Smad4 形成复合物并被转运到核内，Smads 复合物在细胞核中与相关核因子及DNA 结合，进而激活相关基因的转录与蛋白的表达，从而诱导骨骼肌萎缩。而脊髓损伤后，下肢肌肉失去神经支配，泛素‑蛋白酶路径被激活，肌肉特异性泛素蛋白连接酶E3(Atrogin‑1 和MuRF1)与目标靶蛋白结合，形成泛素‑蛋白复合物后传递给26S 的蛋白酶体，促进肌蛋白降解[26‑28]。本研究结果表明，电针干预后能明显下调MSTN、Trim63 和Fbxo32 mRNA 的表达，下调蛋白降解水平，延缓TSCI大鼠下肢肌萎缩。

另外，骨骼肌中肌卫星细胞的增殖分化功能对骨骼肌的修复具有重要作用。Myod和Myog均为生肌调节因子家族成员，对肌卫星细胞的分化起重要调控作用[29‑31]。其中，Myod 为初级分化因子，主导成肌分化；Myog 为次级分化因子，主导肌管的终末分化。本研究结果表明，电针干预能有效上调大鼠腓肠肌中Myod和Myog mRNA的表达，提示电针干预可能通过促进TSCI大鼠腓肠中肌卫星细胞的成肌分化，促进新生肌管的形成，进而延缓下肢肌萎缩。

综上所述，我们推断电针干预TSCI大鼠命门、大椎和双侧足三里穴可能通过下调腓肠肌中MSTN、Trim63 和Atrogin‑1 的表达，抑制肌蛋白的过度降解，同时增加Myod和Myog的表达，促进肌卫星细胞的成肌分化，从而有效延缓大鼠双下肢的腓肠肌萎缩。