广东地区遗传性非综合征型耳聋临床防控模式初探

刘玲 曾玉坤 丁红珂 姚翠泽 余丽华 刘畅 张彦

广东省妇幼保健院医学遗传中心（广州 511400）

耳聋位居我国各类残障之首，据全国第二次残疾人抽样调查主要数据显示我国听力残疾者高达2780万，新生儿耳聋发生率为1‰-3‰，严重影响出生人口素质和国民健康[1]。统计表明60%的耳聋患者为遗传变异所致。遗传性耳聋根据表型分类为综合征型耳聋（约30%）和非综合征型耳聋（约70%）。在非综合征型耳聋中，最常见遗传方式为常染色体隐性遗传[2]。因此，在正常听力人群中存在较多耳聋致病基因突变携带者，发现携带者并进行配偶相关检测可以有效防治遗传性耳聋患儿的发生。

GJB2、SLC26A4、线粒体MT-RNR1基因是中国遗传性耳聋三个最常见的致病基因[2]。本研究对广东地区46587名正常听力育龄女性进行耳聋基因热点突变检测，对于携带者进行配偶相关基因的编码区检测，对于有家族史及产前诊断要求的进行规范化检测；同时对694名非综合征型耳聋患者进行GJB2、SLC26A4基因编码区所在外显子及侧翼区序列检测。初步得到了广东地区遗传性耳聋基因热点突变携带率及非综合征型耳聋患者中常见耳聋基因突变数据；初步完成了广东人群遗传性耳聋出生缺陷防控临床基因检测方案的效果评估。

1 对象与方法

本研究所有对象均为2011年1月至2019年5月期间在广东省妇幼保健院就诊或咨询人员，所有检测方案均经过详细的知情同意告知。

1.1 热点筛查

46587 例正常听力孕前∕产前且无耳聋家族史女性，年龄15～53岁,经受检者知情同意后采集外周血2mL（EDTA抗凝），取300μl全血采用磁珠法提取基因组DNA（厦门至善生物科技有限公司），Nanodrop2000（Thermo，美国）定量后按照说明书用晶芯TM9项遗传性耳聋基因检测试剂盒（北京博奥生物有限公司）进行致聋基因热点突变筛查。

1.2 携带者配偶相应基因检测

采集外周血2mL（EDTA抗凝），取300ul全血采用磁珠法提取基因组DNA（厦门至善生物科技有限公司），Nanodrop2000（Thermo，美国）定量后采用PCR-Sanger技术对受试者采用芯片结合GJB2或SLC26A4基因编码区所在外显子及侧翼区序列测定与分析，其中GJB2基因由于序列短，所有受试者均进行GJB2基因检测。

1.3 耳聋患者检测

经过临床医师评估除了听力障碍外没有其他临床特征的694例非综合征型耳聋患者，年龄2个月～53岁，其中男性和女性分别为378例、316例，除2例患者来自同一家系，其余患者均来自不同家系。所有患者经知情同意后采集外周血2mL（EDTA抗凝），磁珠法提取基因组DNA（厦门至善生物科技有限公司），Nanodrop2000（Thermo，美国）定量后进行芯片结合GJB2和SLC26A4基因编码区所在外显子及侧翼区序列测定及分析。变异生物信息学分析主要采用dbSNP、Clinvar、HGMD、遗传性 耳 聋 网 站（https:∕hereditaryhearingloss.org）和SIFT、PolyPhen、MutationTaster等数据库和软件进行分析。

1.4 产前诊断

80个正常听力孕前∕产前且无耳聋家族史携带者及其配偶为同基因携带者家系和90个有家族史的同基因致病突变携带者夫妇或夫妇双方耳聋且为同基因致病突变携带家系，在进一步知情同意下选择产前诊断。共计170例孕妇经超声介导行绒毛、羊膜腔、脐血穿刺术取得胎儿样本。产前标本DNA提取采用德国Qigen公司生产的QiampDNA Blood MiniKit提取试剂盒进行基因组DNA提取。产前标本采用荧光多重PCR毛细管电泳法同时检测母亲及胎儿13、18、21号染色体上的13个微卫星多态标记以鉴别母血污染后利用PCR-Sanger技术进行特定基因位点的产前基因检测。

表1 13452例育龄女性耳聋筛查情况表Table 1 The prenatal screening of deafness-related genes in 13452 normal hearing women of childbearing age

2 结果

2.1 正常听力育龄女性耳聋热点基因突变筛查

在46587例正常听力育龄女性，共检出携带者1583例，总体携带率为3.40%，其中GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体MT-RNR1基因的携带率分别为1.88%、1.17%、0.14%、0.19%。在携带者中，GJB2基因的235delC和SLC26A4基因IVS7-2A＞G两个位点合计占比达75.8%（表1）。另14例女性筛查提示为双重杂合突变，其中GJB2基因c.235delc双重杂合SLC26A4基因IVS7-2A＞G的基因筛查芯片结果如图1所示。

图1 GJB2基因c.235delC双重杂合SLC26A4基因IVS7-2A＞G的芯片结果Fig.1 The chip result of GJB2 gene c.235delC double heterozygote SLC26A4 gene IVS7-2A＞G

2.2 携带者配偶相应基因检测

1583例携带者中，GJB2、SLC26A4基因致病突变携带者为1431，其中847例GJB2、SLC26A4基因致病突变携带者配偶选择进一步基因检测。共检测到27种变异,其中以GJB2基因的c.109G＞A、c.235delC和SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变为主。在携带者配偶中c.109变异的人群携带率高达15.58%，c.109 G＞A的等位基因频率为8.03%（136∕1694）（表2）。

表2 847例携带者配偶相应基因序列分析结果Table 2 Related gene sequencing results of spouses of carriers

在该部分人群中，2例自诉表现为弱听（基因型分别为GJB2基因c.109G＞A纯合、GJB2基因c.235delC复合c.109G＞A），其余均自诉听力正常。

2.3 694例非综合征型耳聋患者基因检测

2.3.1 694例非综合征型耳聋患者基因检测变异情况

在694例非综合征型耳聋患者中，共检测到78种变异（表3）。

表3 694例非综合征性耳聋患者变异情况表Table 3 Variants in 694 nonsyndromic hearing loss(NSHL)subjects

GJB2基因序列分析发现21种变异，其中14种为已经报道致病突变，另有7种变异与疾病的关系尚未明确。在这个7个意义不明变异中，其中4个变异在dbSNP、Clinvar、HGMD、遗传性耳聋网站（https:∕hereditaryhearingloss.org）等数据库未见报道。

SLC26A4基因序列分析发现54种变异，其中32种为已经报道致病变异，另22种变异与疾病的关系尚未明确。在这22个意义不明变异中，其中16个变异在dbSNP、Clinvar、HGMD、遗传性耳聋网站（https:∕hereditaryhearingloss.org）等数据库未见报道。

另在耳聋患者中，发现20例患者为线粒体MT-RNR1基因致聋突变，在1例患者中发现GJB3基因c.538C＞T杂合变异。

2.3.2 意义不明变异分析

本研究中共发现29种GJB2/SLC26A4变异与疾病的关系尚未明确，其中22种变异在耳聋患者同一基因仅发现1个变异位点或2个同基因变异位点均为未明确致病变异或已发现2个明确致病位点，根据ACMG分类指南其致病性尚不明确。另7种变异数据库未见报道且在耳聋患者中仅复合杂合1个已知致病突变，其中GJB2基因c.191G＞C和SLC26A4基因c.419C＞T根据ACMG分类指南可分类为可能致病变异，具体临床资料和致病性分析如下：

患者1临床表现为先天性极重度双侧感音神经性耳聋，无耳聋家族史，基因型为GJB2基因c.235delC复合杂合c.191G＞C（未行双亲验证）。SIFT、PolyPhen、MutationTaster等预测软件提示为c.191G＞C(p.C64S)致病突变，文献报道[3]同一位点c.191 G＞A(p.C64Y)与感音神经性耳聋相关，据此按照ACMG分类指南可将c.191 G＞C分类为可能致病变异。

患者2-7临床均表现为先天性双侧耳聋、耳部CT提示双前庭导水管扩大等，均无耳聋家族史，序列分析提示除1个SLC26A4基因致病突变外，均复合杂合1或2个数据库未见报道变异，分别为c.304+3delA、c.380A＞G、c.419C＞T、c.956T＞G∕c.958G＞A、c.1352C＞A，SIFT、PolyPhen、MutationTaster等预测软件提示上述位点为致病突变。c.419 C＞T（p.P140L）经后代验证该变异与另1致病突变以反式方式排列，且同一位点c.419C＞A（p.P140H）有文献报道[4]与Pendred综合征相关,根据ACMG分类指南可将其分类为可能致病。其余4例患者均因未进行双亲或后代验证，根据ACMG分类指南将其分类为意义不明变异。

2.3.3 同一个基因多位点变异位于同一条染色体的患者情况

8例患者经过序列分析发现同一基因存在3个位点变异或者1个位点纯合变异复合另1位点杂合，基因型分别为：GJB2基因c.235delC纯合+c.299delAT杂合、GJB2基因c.235delC纯合+c.282C＞T杂合、SLC26A4基因c.1229C＞T杂合+c.956T＞G 杂 合 +c.958G＞A 杂 合 、SLC26A4基 因c.1975G＞C杂合+c.1229C＞T杂合+c.1548_1549ins C杂合、SLC26A4基因IVS 7-2A＞G杂合+c.1229C＞T杂合+c.1975G＞C杂合、SLC26A4基因IVS 7-2A＞G杂合+c.1588T＞C杂合+c.1578C＞A杂合、SLC26A4基 因 IVS7-2A＞G 杂 合 +IVS13+5G＞A 杂 合 +c.1300G＞A杂合、SLC26A4基因IVS7-2A＞G杂合+c.1174A＞T杂合+c.463A＞G杂合。

基因型为SLC26A4基因c.1975G＞C杂合+c.1229C＞T杂合+c.1548_1549insC杂合的患者经过家系分析提示c.1975G＞C、c.1229C＞T位于同一条染色体，遗传自父亲。其余7例患者均未选择进一步双亲验证，通过基因型分析2例基因型分别为GJB2基因c.235delC纯合+c.299delAT杂合,GJB2基因c.235delC纯合+c.282C＞T杂合的患者中c.235delC、c.299delAT和c.235delC、c.282C＞T也位于同一条染色体。

2.4 产前诊断检测结果

共计170对同基因致病突变携带者夫妇通过知情选择产前诊断，其中39例胎儿遗传了来自父母双方的基因突变、45例胎儿未遗传来自父母双方的基因突变，86例为携带者（表4）。

术后随访，24例孕妇因胎儿遗传来自父母双方基因突变选择终止妊娠，另有1例因合并其他超声畸形选择终止妊娠。25例终止妊娠胎儿中，8例产前诊断基因型为c.109G＞A纯合或复合其他已知致病突变（5例有耳聋家族史）。产后电话随访进行产前诊断孕妇的新生儿听力情况，所有成功随访家庭均自诉新生儿听力筛查均为正常，其中包含8例产前诊断基因型为GJB2基因c.109G＞A纯合或复合其他已知致病突变新生儿。

表4 170例胎儿产前诊断结果Table 4 Prenatal diagnosis results of 170 fetuses

3 讨论

截止到目前，已经鉴定出119个基因与非综合征型耳聋相关，其中76个基因与常染色体隐性非综合征性耳聋基因相关[6]。在我国常见的非综合征型耳聋致病基因为GJB2、SLC26A4、线粒体MT-RNR1。

在本研究中，46587例正常听力育龄女性耳聋基因热点突变检测结果提示人群耳聋基因突变携带率为3.40%，其中GJB2、SLC26A4、GJB3、MT-RNR1基因的热点突变阳性率分别为1.88%、1.17%、0.14%、0.19%。携带者中以GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因IVS7-2A＞G居多，两个位点合计占比高达75.8%。这与我们早期报道数据一致[7，8]。人群携带率略低于国内其他地区相关报道[9，10]。

此外，本研究在46587例正常听力且无耳聋家族史的育龄女性中分别检测到线粒体MT-RNR1、GJB3基因突变携带者89例、63例。线粒体MT-RNR1基因突变是氨基糖苷类药物致聋的重要机制，绝大部分为母系遗传。对于筛查提示为线粒体MT-RNR1基因突变的携带者，均建议本人、子女及其母系亲属禁止使用氨基糖苷类药物并提供用药指南。GJB3基因为我国克隆的第一个基因，早期研究认为其与常染色显性遗传的高频听力受损相关[11]，但近年来该对该变异的致病性存在争议[12]。本研究随访63例GJB3基因c.538C＞T携带者，针对听力情况特别是高频区域是否受损进行问询，所有受检者均自诉听力正常但未进行耳鼻喉科专业检查，其中包含1例c.538C＞T纯合受检者。对此，临床上GJB3基因c.538C＞T携带者的遗传咨询建议需要谨慎。

遗传性耳聋有明显的地区及种族差异，不同地区及种族在基因突变谱及突变频率存在差异性。例如在东亚人群中GJB2基因以c.235delC为主，而在犹太人群种以c.167delT为主，而c.35delG突变在欧洲和美国更为普遍[13]。在本研究中，c.35delG在正常听力育龄女性中仅检测到3例，在耳聋患者中未发现。在东亚地区，GJB2基因和SLC26A4基因的突变谱大部分一致，但是各突变位点在不同人群中的频率却存在差异。本研究数据及其他国内研究[14]显示，IVS7-2A＞G是中国人SLC26A4基因最常见的致病突变，但是在日本[15]和韩国[16]SLC26A4基因最常见的致病突变为c.2168A＞G。本研究收集我院近8年四万多例数据，能较好地反映广东地区正常听力育龄女性耳聋基因携带情况。

在847例携带者配偶相应基因检测中，我们发现15.58%的受检者带有c.109变异，其中6例基因型为c.109G＞A纯合或复合杂合c.235delC，除2例自诉为弱听外其他均无耳聋临床表现。在694例耳聋患者中c.109G＞A的阳性率高达25.22%，其中c.109G＞A纯合或复合GJB2基因其他已知致病突变位点的耳聋患者为56例。56例患者临床表现差异巨大，从单侧到双侧、先天到后天渐进、轻度到极重度耳聋患者均有出现。随访成功的7例产前诊断基因型为c.109G＞A纯合或复合杂合GJB2基因其他已知致病突变的新生儿，家属均诉通过,但是后期的临床表型仍需进一步随访。c.109G＞A的临床致病性仍存在争议，目前研究认为其致病可能性较大[17，18]，但临床表型异质性大，多表现为轻度或中度耳聋，且发病年龄不一。本研究中，c.109G＞A在患者中的等位基因频率为15.56%，明显高于正常听力的携带者配偶人群中的等位基因频率（8.03%），这一结果也为GJB2基因c.109G＞A为致病性突变提供了证据。临床对于c.109G＞A的遗传咨询建议，需要充分告知其临床表型的异质性，以及定期监测听力情况的必要性。

在694例非综合征型耳聋患者中，共检测到78种变异，其中GJB2、SLC26A4基因共检测到75种变异。在75种GJB2、SLC26A4基因变异中，除已报道46个GJB2、SLC26A4基因的致病突变，还发现29个意义不明变异，其中20个变异在dbSNP、Clinvar、HGMD、遗传性耳聋网站（https:∕hereditaryhearingloss.org）等数据库未见报道，进一步丰富了遗传性耳聋的基因突变谱。临床遗传咨询中，对于携带意义不明变异耳聋患者，需从临床表型、遗传方式、生物信息学分析、家系分析、功能分析等多方位综合告知其致病性分析推测结果。本研究中，c.304+3delA、c.380A＞G、c.956T＞G∕c.958G＞A、c.1352C＞A根据ACMG分类指南与疾病的关系尚未明确，除了功能学分析需要进一步研究外，家系分析对于变异致病性分类推测是较为容易实现的环节，但是部分临床医生和患者对家系分析的重视度不够，以至于对于该类变异的分类尚不能明确。对于分析推测为可能致病的变异，如本研究中的GJB2基因c.191G＞C和SLC26A4基因c.419C＞T，尚需更多患者和功能研究验证其致病性，对于携带该类变异患者需要知情告知其风险。对于其他意义不明变异，其不排除检测范围外的其他致病突变或其他致病基因致病可能性，遗传咨询建议患者亲属知情选择相应基因检测或者患者进一步检测。近年来，随着技术的不断更新和测序技术成本的降低，高通量测序在临床应用越来越广泛的应用，虽然目前高通量测序在临床的大规模使用尚存在一系列问题，但相信随着技术的进一步发展，更多未明确诊断的患者能够得到诊断。

另在遗传咨询中，需要注意对于同一基因多位点突变的患者进行双亲或者后代验证。在本研究中有8例患者经过序列分析存在同一个基因多位点变异位于同一条染色体的情况，其中5个家系未排除致病突变为反式排列的情况，不排除同一基因多位点突变位于同一染色体，不排除其为SLC26A4基因致病突变携带者的情况。

此外，在非综合征型耳聋患者中，GJB2基因c.109、c.235delC、c.299_300delAT及SLC26A4基因IVS7-2A＞G、c.754T＞C、c.1229C＞T、c.2086C＞T、c.1548insC、c.2168A＞G 和线粒体MT-RNR1基因m.1555A＞G为最常见的热点突变，与目前国内其他地区已报道文献部分等位基因频率存在差异[19，20]，与这为中国人群遗传性耳聋基因突变热点筛查工作提供了广东地区重要的参考信息，但对于耳聋筛查热点突变的筛选尚需国内多地区、大样本进一步研究。

本研究通过分析广东地区46587例正常听力育龄女性的耳聋基因筛查情况及694例非综合征型耳聋患者的遗传性耳聋基因突变谱，对广东人群遗传性耳聋出生缺陷临床防控模式进行大样本的探索，为耳聋基因筛查方案、耳聋诊断策略及遗传咨询补充了重要数据依据。