阴地蕨不同采收期木犀草素含量的动态积累研究

李俊雅　李君　梁晓

【摘 要】 目的：研究阴地蕨中化学成分木犀草素的动态积累。方法：采用反相-高效液相色谱法测定不同产地、不同采收期、不同部位阴地蕨药材中木犀草素的含量，色谱柱：色谱柱为菲罗门ODS（150mm×4.6mm，4μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）;体积流量：1mL·min-1;检测波长：360nm。样品平均回收率为98.18%，RSD为1.09%（n=6）。结果：阴地蕨药材中木犀草素的含量在不同生长时期、不同部位有明显的变化规律。不同部位木犀草素的含量由高到低的顺序为：叶、茎、根;一年生长期内在8月份阴地蕨根、茎、叶中木犀草素的含量最高。结论：阴地蕨中木犀草素的积累动态将为阴地蕨生物特性的形成及阴地蕨药材采收期提供一定的科学依据。

【关键词】 阴地蕨;木犀草素;反相-高效液相色谱法;动态积累

【中图分类号】R284.9 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）15-0021-04

阴地蕨为阴地蕨科植物阴地蕨Botrychium ternatum （Thunb.）Sw.的全草。广泛分布于云南、贵州、湖北、湖南、广西等地，《中华本草》[1]和《中药大辞典》中均有收录[2]。传统中医认为阴地蕨味甘、苦，性微寒，具有清热解毒，平肝熄风，明目去翳之功效。临床常用于小儿高热惊搐，肺热咳嗽，目赤翳障等症的治疗。现代药理学实验证实，阴地蕨中的木犀草素具有多种药理活性：抗炎、抗过敏、镇咳、抗纤维化、抑制肿瘤细胞增殖等作用[3～5]。

随着最近几年国家的 “精准扶贫”政策，广大山区种植中药材业已成为不少农村脱贫致富的好途径，阴地蕨作为云贵地区的民族药，分布十分广泛，具有较大的研究和开发意义。但作为人工种植的阴地蕨药材，目前国内尚无统一的质量标准。为了更好地开发利用这一药材资源，笔者对其中木犀草素含量的动态积累规律进行了研究。

1 仪器和试剂

1.1 仪器 UV-2201型紫外分光光度计（日本岛津仪器公司），LC-20A T高效液相色谱仪（日本岛津仪器公司，SPD-20A型紫外检测器，CTO-10AS vp型柱温箱，CBM-102型工作站），SY25-1200型超声波清洗器（张家港市三友超音设备有限公司），0.45μm微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司），高速万能粉碎机（长沙旭众机械设备有限公司）。

1.2 药材 研究所用阴地蕨样品分别在国内3个省区（云南省昆明市西山区，贵州省铜仁市万山区，湖南省益阳市安化县）收集，共24份，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定，所采集样品均为阴地蕨科（Botrychiaceae）植物阴地蕨（Botrychium ternatum）的全株。2018年6月至2019年9月采收阴地蕨全株，洗净，晒干。

1.3 试剂 木犀草素对照品（中国食品药品检验研究院，批号：111520-201605），乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170615）、甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170814）、异丙醇（天津四友精细化学品有限公司，批号：20170513）为色谱纯，实验研究所用其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 取木犀草素对照品0. 50mg，精密称量，置于5mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 阴地蕨供试品溶液制备 取阴地蕨样品粉末（过三号筛）1.0g，精密称定，将药材粉末置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声（功率500W，频率40kHz）处理45min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[6-7]。

2.3 色谱条件及适应性试验 色谱柱为菲罗门ODS（150mm×4.6mm，4μm）;流動相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）;流速1mL·min-1;柱温为30℃;检测波长为350nm。在此条件下，理论板数按木犀草素峰计算应不低于5000。

2.4 测定法 分别精密吸取木犀草素对照品溶液与阴地蕨供试品溶液各20μL，注入液相色谱，测定，即得，结果见图1、图2。

2.5 线性关系考察 分别从0.104mg·mL-1的标准溶液中吸取5、10、15、20、25μL，作HPLC分析。以峰面积（Y）为纵坐标，木犀草素对照品含量（X）为横坐标，绘制标准曲线。数据经回归处理，得木犀草素的线性方程为：Y=2175628X+2104，r=0.9998，表明木犀草素的进样量在0.251～2.004μg范围内时线性良好。

2.6 精密度试验 取木犀草素对照品溶液，连续进样6次，测得各次峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）值，结果见表1。

2.7 稳定性试验 取阴地蕨药材药材粉末1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.3”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24h依次注入高效液相色谱仪，进行HPLC分析，测得每个时间点木犀草素的峰面积，并计算其RSD（%）值，结果见表2。

2.8 重复性试验 取阴地蕨药材1g，精密称定，按照“2.2项 阴地蕨供试品溶液制备”的方法，平行制备样品溶液6份，分别进样20μL，进行HPLC分析，测定样品含量，并其计算RSD值，结果见表3。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的阴地蕨药材样品粉末6份，各约0.5g，精密称定。分别精密加入浓度为0.104mg·mL-1的木犀草素对照品溶液1.5mL，按 “2. 2”项下方法制备供试品溶液，进样20μL，按 “2. 3”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表4。

2.10 样品测定 取不同产地、不同采收期、不同部位（根、茎、叶）的阴地蕨药材适量，精密称定，按供试品溶液制备（2.2）项下制备样品溶液。取样品溶液和木犀草素对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，计算木犀草素的含量，结果见表5。

3 结论

经查阅相关文献可知[8-9]：阴地蕨木犀草素易溶于甲醇，故在实验中选择甲醇作为提取溶剂。在实验中先后考察了回流提取法与超声提取法，通过HPLC分析对比，发现上述两种提取方法所得的阴地蕨药材中木犀草素含量相似。但超声提取法更快捷、方便， 故选用超声提取法对阴地蕨药材样品进行处理。同时，在实验中还对流动相的比例（体积）进行了充分的考察，选用甲醇-乙腈-水（20∶40∶40）、乙腈-水（42∶58）、甲醇-醋酸-水（60∶0.1∶39）等作流动相，木犀草素的分离度和理论塔板数均达不到要求。经过多次、反复摸索实验条件，发现采用乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）为流动相，木犀草素可以与相邻成分达到基线分离，峰形较好，基线平稳，符合要求[10-11]。

分别对不同产地、不同采收期、不同药用部位阴地蕨中木犀草素的含量进行了测定。实验结果表明：不同产地的阴地蕨药材在同一采收期木犀草素的含量无明显差异;不同部位阴地蕨药材中木犀草素的含量差别很大，即叶>茎>根;不同产地阴地蕨药材中木犀草素的含量呈规律性变化，其中6月初到7月中旬木犀草素的含量呈上升趋势，7月下旬到8月上中旬含量较高，随后逐渐下降。故建议阴地蕨的根不作为入药部位，以地上部分作为入药部位，每年8月份为阴地蕨药材的最佳采收期。

参考文献

[1]国家中药管理局编委会.中华本草（第二册）[M].上海：上海科学技术出版社，1999：69.

[2]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1362.

[3]刘立新，邹冬玉，张羽男，等.木犀草素·4，4′-联吡啶药物共晶对小鼠巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用研究[J].中国药房，2018，29（5）：602-606.

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[6]戴勝，秦亚东，梁枫.不同产地壮药夜香牛中木犀草素的含量测定[J].中国民族民间医药，2017，26（20）：18-20.

[7]李洁玉，周浓，阳文武，等.HPLC法测定仙桃草中芦丁、犀草苷、木犀草素的含量[J].西南师范大学学报（自然科学版），2017，42（8）：80-84.

[8]戴胜，秦亚东，梁枫.UPLC同时测定野菊花药材中10个黄酮和有机酸的含量[J].药物分析杂志，2019，39（3）：451-457.

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[10]黄慧，王晓琴，杜月，等.HPLC法同时测定漏芦花中6个成分的含量[J].药物分析杂志，2017，37（6）：956-961.

[11]魏敏，孙璇.RP-HPLC同时测定硬尖神香草中4种成分含量[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（11）：77-79.

（收稿日期：2019-05-09 编辑：刘斌）