基于挥发性组分结合化学计量学方法的铁观音乌龙茶和软枝乌龙茶模式识别分析

晏祥文，钟一平，吕世懂，孟庆雄

（1.曲靖市粮油产品质量监督检验站，云南曲靖655000；2.昆明市粮油饲料产品质量检验中心，云南昆明 650118；3.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

乌龙茶，是我国六大茶类中独具鲜明特色的茶叶品类。乌龙茶是经过杀青、萎凋、摇青、烘焙等工序后制出的品质优异的茶类[1]。乌龙茶综合了绿茶和红茶的制法，其品质介于绿茶和红茶之间，既有红茶浓鲜味，又有绿茶清芬香并有“绿叶红镶边”的美誉[2]。

我国乌龙茶因其不同产区、加工工艺及风味特征，一般分为福建的闽南乌龙和闽北乌龙、广东乌龙和台湾乌龙，其中闽南乌龙和台湾乌龙的产量相对较大。福建闽南乌龙茶的典型代表是铁观音乌龙茶，而台湾乌龙茶的典型代表是软枝乌龙茶，这两种乌龙茶具有一些相似的感官特征，比如色泽、滋味和气味等。铁观音是采用铁观音茶树品种为原料制成，其独具“观音韵”，清香雅韵，冲泡后有天然的兰花香，滋味纯浓，香气馥郁持久，有“七泡有余香之誉”[3]。台湾软枝乌龙茶具有典型的花果香味，软枝茶园均在海拔1 000 多米以上[4]。蔡烈伟等[5]对不同产区乌龙茶感官品质与茶汤化学成分进行分析，结果发现不同产区的乌龙茶感官审评得分非常相近，其中特别是闽南乌龙和台湾乌龙的品质最接近，闽南乌龙以滋味品质以醇厚甘爽为主，香气品质以清高有花香为主，台湾乌龙滋味以甘醇鲜爽为主，香气馥郁有花香。综上，通过一些仪器分析手段对两种茶叶进行识别区分是十分有必要的。

香气是影响茶叶品质的重要因素之一，对茶叶品质的贡献率较高[6]。顶空固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）是一种集采样、萃取、浓缩、进样于一体的无任何溶剂的样品微萃取技术，比起溶剂萃取法，它能较真实的反映样品的香气成分信息，目前被广泛应用于各种食品香气成分的萃取[7-9]。另外，化学计量学方法已经被广泛应用于各种不同产地和类别食品的模式识别分析，它基于数学、统计学、化学及计算机科学的方法和原理，设计优化试验，挖掘与处理、分辨与解析试验量测数据的信息，从而获取复杂分析体系中隐含的有用信息。其中的多类聚类和判别分析方法主要包括主成分分析（principle component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares- discriminant analysis，PLS-DA）、聚类分析（cluster analysis，CA）、人工神经网络（artificial neural network，ANN）和支持向量机（support vector machine，SVM）等[10-14]。

目前，关于乌龙茶挥发性成分的相关研究已有一些报道，但大多数停留在单一茶样、不同工艺或香气之间的比较研究上[15-17]，对不同品种和不同省份的乌龙茶香气成分的综合比较及其模式识别分析方面的研究较少，特别是基于化学计量学来区分不同省份乌龙茶的研究也鲜有报道。另外，消费者对不同产地乌龙茶的风味品质特征虽有一定的了解，但是对其之间的具体品质化学成分差异却不清楚，同时来自于不同产区但具有相似的品质特征的茶叶之间可能还会出现以假乱真、扰乱市场的情况。因此，本研究以这两种不同产地的乌龙茶为研究对象，采用全自动HS-SPME和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对他们的香气成分进行研究，并结合化学计量学方法中的PCA 和PLS-DA 来进行模式识别，以期为乌龙茶的生产加工以及质量控制提供一些理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 种福建铁观音茶（编号为FO1-FO4）、3 种台湾软枝乌龙茶（编号为TO1-TO3）：云南省茶叶批发市场，等级为一级，均生产于2017年。

7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪（配全自动顶空进样装置）：美国Agilent 公司；固相微萃取装置（萃取纤维头为 65 μm PDMS/DVB）：美国 Supelco 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 茶叶香气成分的萃取

茶叶样品事先粉粹好，过40 目筛。称取每种茶叶样品各2.00 g 装入20 mL 顶空瓶中，然后加入5 mL 烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口。全自动顶空进样装置条件：首先80 ℃保持10 min，然后80 ℃吸附60 min，最后解吸附3.5 min[18]，每个样品重复测定两次。

1.2.2 气相色谱-质谱方法

GC 条件：HP-5MS 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为 250 ℃；载气为高纯氦气，载气流速为 1.0 mL/min；柱温条件：50 ℃（5 min），以 3 ℃/min 升至 210 ℃（3 min），再以 15 ℃/min 升至230 ℃（0 min）；不分流进样模式。

MS 条件：离子源为 EI，离子源温度 280 ℃，传输线温度290 ℃，质量扫描范围m/z 35～500，溶剂延迟时间为2.8 min。

1.2.3 数据处理与分析

将GC-MS 分析得到的MS 信息在NIST 08.L 谱库中进行检索，以质谱匹配度为鉴定结果，所鉴定出的化合物质谱匹配度需高于80%。同时采用峰面积归一化法进行定量，得到各组分的相对含量。多元统计学方法采用SIMCA-P15 软件。

2 结果与分析

2.1 两种乌龙茶香气成分分析

按照上述的GC-MS 分析条件，分别对4 种福建铁观音茶和3 种台湾软枝乌龙茶的香气成分进行分析，它们的总离子流色谱图如图1、图2 所示，香气成分及其相对含量分析结果如表1 所示。

图1 福建铁观音乌龙茶（编号FO3）挥发性成分的总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the Fujian Tieguanyin oolong tea（No.FO3）

图2 台湾软枝乌龙茶（编号TO3）挥发性成分总离子流色谱图Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the Taiwan Ruanzhi oolong tea（No.TO3）

表1 福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶香气成分分析结果Table 1 GC-MS analysis results of volatile components in Fujian Tieguanyin oolong tea and Taiwan Ruanzhi oolong tea

续表1 福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶香气成分分析结果Continue table 1 GC-MS analysis results of volatile components in Fujian Tieguanyin oolong tea and Taiwan Ruanzhi oolong tea

由表1 可知，在所有的7 个乌龙茶中共鉴定出香气成分71 种，主要包括醇类、碳氢化合物、酯类、含氮化合物、酮类、内酯类等。发现两种不同产地的乌龙茶在香气组成上较为接近，但部分化合物之间还是体现出了一些差异性。当然，即便是产自于同一个省份的乌龙茶，它们之间在原料具体产地、环境条件、原料选择上不可能完全一致，所以也体现出了一些差异性。福建铁观音乌龙茶中含量最高的有橙花叔醇、吲哚、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、α-法呢烯、丁酸苯乙酯、己酸-2-苯乙酯、己酸-3-己烯酯、茉莉内酯、植醇、苯乙醇、芳樟醇、依兰烯、茉莉酮等。台湾软枝乌龙茶中含量较高的主要是香叶醇、吲哚、芳樟醇、橙花叔醇、脱氢芳樟醇、α-法呢烯、茉莉内酯、咖啡因、茉莉酮、水杨酸甲酯、茉莉酮酸甲酯、苯乙腈、植醇、己酸-3-己烯酯等。

2.2 福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶香气组分对比分析

通过表1 可以发现，尽管两种不同产地的乌龙茶在香气组成上较接近，但他们在香气成分上还有一定的差异性。福建铁观音乌龙茶中橙花叔醇、苯乙醇、（E）-β-法呢烯、（Z，E）-α-法呢烯明显高于台湾软枝乌龙茶，而台湾软枝乌龙茶中香叶醇、水杨酸甲酯、顺-3-己烯醇苯甲酸酯、茉莉酮酸甲酯明显高于福建铁观音乌龙茶。另外异丁酸苯乙酯、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、己酸异戊酯、2-庚醇仅在福建铁观音茶中检出，而δ-杜松烯仅在台湾软枝乌龙茶中检出。两种不同产地的乌龙茶香气成分的一致性和他们加工工艺有很大的关系，而不同的产地、茶树品种等因素还是导致了他们之间有一定的差异性。仅仅通过对表1 的分析，还是不能较直观的对两种不同省份的乌龙茶进行一个识别和区分，因此还需要借助多元统计学方法进一步分析。

2.3 基于两种不同产地乌龙茶挥发性成分的多元统计学分析

2.3.1 主成分分析

主成分分析是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。在用统计分析方法研究多变量的茶叶挥发性组分时，变量个数太多就会增加分析的复杂性，尤其是针对于这种类别分析。主成分分析就是研究如何通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构，即从原始变量中导出少数几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关。通常数学上的处理就是将原来P 个指标作线性组合，作为新的综合指标[19]。将所分析茶叶样品的香气成分含量表输入多元统计学软件SIMCA-P15 中进行分析，得到主成分得分图如图3 所示，各变量载荷图如图4 所示。

图3 福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶的主成分得分图Fig.3 PCA score scatter plot from PC1 and PC2 in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

图4 基于主成分分析的福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶的变量载荷图Fig.4 PCA loading plot of 71 variables utilized from PC1 and PC2 in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

从图3 可以看出，两种不同省份的乌龙茶之间还是有一个明显的区分，台湾软枝乌龙茶聚在了左边，而福建铁观音乌龙茶聚在了右边，这说明通过主成分分析可以实现这两种不同省份乌龙茶的区分。但通过图4 的载荷图还是不太能看得出来具体决定他们实现区分的关键变量，因为所有变量都比较分散，难以发现有价值的信息。因此，需进一步的进行正交偏最小二乘判别分析来挖掘有用的信息。

2.3.2 正交偏最小二乘判别分析

偏最小二乘法判别分析是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，是一种有监督的判别分析方法。其原理是对不同处理样本（如观测样本、对照样本）的特性分别进行训练，产生训练集，并检验训练集的可信度[20]。同主成分分析一样，将表1 导入SIMCA-P15中进行OPLS-DA 分析，其中TO1～TO3 为一组，FO1～FO4 为另外一组，得到这种判别分析的得分图和SPlot 图，如图 5、图6 所示。

图5 基于偏最小二乘法判别分析的福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶的得分图Fig.5 The partial least squares discriminant analysis of score scatter plot in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

图6 基于偏最小二乘法判别分析变量的S-plot 图Fig.6 The partial least squares discriminant analysis of S-plot of 71 variables

从图5 可以看出，两种不同产地的乌龙茶之间实现了很好的区分。在图6 的S 形的两个角的变量，可能就是所寻找的两种不同类型茶叶的典型香气成分差异物。其中变量56（橙花叔醇）、变量31（香叶醇）、变量17（芳樟醇）、变量49（2-甲基丁酸-2-苯乙酯）等可能对他们的分类贡献较大。为了具体的看出每一种挥发性成分的这种贡献，在放大试验次数为200 的情况下，接着进行两组变量的可变信息处理（variable information processing，VIP）预测值分析，得到 VIP 图如图7 所示，同时导出了VIP 数值表，加在了表1 上。

在代谢组学中，一般认为VIP 值大于1 的变量可能为两组化合物的差异代谢物。通过图7 和表1 的VIP 值，发现香叶醇、橙花叔醇、芳樟醇、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、水杨酸甲酯、α-法呢烯、苯乙醇、茉莉酮酸甲酯的值均大于1，这几种挥发性化合物可能是两组茶叶中差异较大的化合物，对它们的区分起到了关键的作用。

图7 福建铁观音乌龙茶和台湾软枝乌龙茶中的71 中挥发性组分VIP 预测值图Fig.7 The VIP predicted values plot of 71 variables in the Fujian Tieguanyin oolong teas and Taiwan Ruanzhi oolong teas

茶叶的挥发性组分主要受到制茶品种、制茶工艺和茶叶产地的影响[21]。两种不同产地的乌龙茶香气成分一致性和它们的制作工艺密不可分，但它们茶叶成分上的差异性可能与茶叶产地、茶树品种等因素有关。铁观音茶是采用铁观音茶树品种制作而成，而台湾茶树乌龙茶主要是采用金萱茶树品种制作而成。另外，不同产地的气候和地理环境因素也导致了他们香气成分上的差异。本研究仅仅是一个比较两种不同产地乌龙茶香气成分的一个基础性研究，下一步，将进一步增加样品的采集量，对两种不同乌龙茶的差异进行一个大样本的大数据研究，同时结合化学计量学方法，进一步对他们的关键差异信息进行挖掘。

3 结论

本研究通过HS-SPME 来提取两种乌龙茶的挥发性成分，并利用GC-MS 进行定量分析，并进一步利用多元统计学方法来对这两种茶叶进行区分，同时进一步挖掘他们的差异性挥发性成分。结果显示，在所有的7 种乌龙茶中共鉴定出挥发性成分71 种，主要包括醇类、碳氢化合物和酯类化合物，其余化合物含量均较低。经对比发现，两种不同产地的乌龙茶在挥发性组成上具有一定的相似性，但也体现出了一些差异性，利用PCA 和OPLS-DA 分析，两种茶叶能实现较好的区分，并通过进一步的分析发现香叶醇、橙花叔醇、芳樟醇、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、水杨酸甲酯、α-法呢烯、苯乙醇、茉莉酮酸甲酯可能是导致两种茶叶差异的关键性化合物。总之，两种乌龙茶香气成分的相似和差异性，与它们相同的生产工艺和不同的茶树品种和产地因素密切相关。下一步还将进一步增加样品的采集量，对两种不同乌龙茶的差异进行一个大样本的大数据研究，同时结合化学计量学方法，对他们的关键差异信息进行挖掘，以期为我国乌龙茶的质量控制和品牌建设提供一定的理论参考。