藜麦麸皮皂苷超临界CO2萃取工艺优化

杨端

（郑州工业应用技术学院，河南郑州451100）

藜麦（Chenopodium quinoa willd.）是藜科藜属双子叶的植物，原产地是南美地区，又被称为南美藜等。是被发现种植距今已经5000 多年，在我国分布也比较广泛，在青海、甘肃、内蒙古等地种植面积非常大[1]。藜麦含有大量的蛋白以及营养素，如铁、钙、维生素等，还含有必需氨基酸以及多种生物活性物质[2]，藜麦营养价值非常高，在国际上有记载，被列为全球范围内十大营养食品之一[3-4]。专家研究得出，经常以藜麦为食物对高血压、心脏病、高血糖以及高血脂等病症均有较好的防治功效。藜麦麸皮是藜麦生产加工中的一种产量较高的副产物，目前来看，藜麦麸皮附加值很低，较少的被利用，甚至作为饲料以及被弃掉，藜麦麸皮中同样含有重要的功能活性物质，如含有藜麦皂苷，其对增强机体免疫力、抗疲劳、抗癌等有都有明显功效[5-6]。超临界CO2萃取技术是一种新兴的高新提取技术，该技术可以用于植物活性成分的提取等方面[7]。具有污染小、废弃物排放少、低毒、高效率等优点[8]。目前乙醇回流法提取藜麦皂苷、超声波提取法提取藜麦皂苷和闪式提取法提取藜麦皂苷研究较多[9]，超临界萃取法提取藜麦皂苷还尚未有所报道，因此，本研究采用藜麦麸皮为主要原料，采用超临界萃取技术提取皂苷，对藜麦皂苷高质量高效率提取具有重要意义，超临界技术提取可大大提高藜麦麸皮的附加值，为藜麦麸皮皂苷进一步开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦麸皮：陕西藤迈生物科技有限公司；无水乙醇、甲醇、石油醚、冰乙酸、高氯酸、香草醛等均为分析纯：北京化工厂。

1.2 仪器与设备

SFE420-40-200 型超临界CO2萃取仪：江苏温奥机械设备有限公司；FA2104B 型电子天平：上海康路仪器设备有限公司；HH-11-1 型水浴锅：上海奥旗仪器设备有限公司；VIS-721 型可见分光光度计：上海平轩科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麦麸皮皂苷提取工艺流程

藜麦麸皮→淋洗→沥水→烘干（80 ℃）→粉碎（过120 目筛）→超临界萃取→皂苷→测定

1.3.2 藜麦麸皮皂苷提取单因素试验

1.3.2.1 超临界压力对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

在超临界温度60 ℃，萃取时间90 min，乙醇浓度70%的条件下，超临界压力分别为 25、30、35、40、45 MPa时，以藜麦麸皮皂苷提取率为评价指标，研究超临界压力对藜麦麸皮皂苷提取率的影响。

1.3.2.2 超临界温度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

在超临界压力35 MPa，萃取时间90 min，乙醇浓度 70%时，超临界温度分别为 50、55、60、65、70 ℃的条件下，以藜麦麸皮皂苷提取率为评价指标，研究超临界温度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响。

1.3.2.3 萃取时间对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

在超临界压力35 MPa，超临界温度60 ℃，乙醇浓度 70%时，萃取时间分别为 70、80、90、100、110 min 的条件下，以藜麦麸皮皂苷提取率为评价指标，研究萃取时间对藜麦麸皮皂苷提取率的影响。

1.3.2.4 乙醇浓度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

在超临界压力35 MPa，超临界温度60 ℃，萃取时间90 min 时，乙醇浓度分别为60%、65%、70%、75%、80%的条件下，以藜麦麸皮皂苷提取率为评价指标，研究乙醇浓度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响。

1.3.3 藜麦麸皮皂苷提取工艺优化

根据单因素结果，以超临界压力（A）、超临界温度（B）、萃取时间（C）、乙醇浓度（D）做因素，以藜麦麸皮皂苷提取率（Y）为指标，设计四因素三水平响应面试验，确定藜麦麸皮皂苷提取最佳工艺参数。试验设计因素水平见表1。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 藜麦麸皮皂苷含量的测定

采用香草醛一高氯酸法，吸取200 μL 皂苷粗提液加入试管中，80 ℃水浴挥发除去甲醇，加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、加入高氯酸0.8 mL，于80 ℃水浴震荡20 min 后立即用冷水冷却5 min；再向其中加4 mL 冰乙酸进行稀释处理，常温条件下静止25 min，以没有加入皂苷的空白管作为对照试验，546 nm 测定吸光度，并且进行3 次平行试验。以齐墩果酸为标准品，得到其标准曲线：Y= 63.285X-0.006（0～0.03 mg/mL，R2=0.999 8）。皂苷含量以每100 g 藜麦粉中所含相当于齐墩果酸的量毫克数表示[10-11]。

式中：Y 为皂苷浓度，mg/mL；V 为皂苷粗提液的总体积，mL；M 为藜麦粉干重，g。

2 结果与分析

2.1 藜麦麸皮皂苷提取单因素试验结果

2.1.1 超临界压力对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

超临界压力对藜麦麸皮皂苷提取率的影响见图1。

图1 超临界压力对藜麦麸皮皂苷提取率的影响Fig.1 Effect of supercritical pressure on the extraction rate of quinoa bran saponins

根据图1，当超临界压力为25 MPa 时，藜麦麸皮皂苷提取率最低，当超临界压力升高后，藜麦麸皮皂苷提取率逐渐升高，当超临界压力达到35 MPa 时，藜麦麸皮皂苷提取率达到0.94%，上升变得缓慢，几乎不再变化，综合考虑生产效率，选择超临界压力为30、35、40 MPa 为响应面研究水平。

2.1.2 超临界温度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

超临界温度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响见图2。

图2 超临界温度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响Fig.2 Effect of supercritical temperature on the extraction rate of quinoa bran saponins

由图2 可知，当超临界温度为50 ℃时，藜麦麸皮皂苷提取率最低，随着超临界温度的上升，藜麦麸皮皂苷提取率先升高后降低，当超临界温度为60 ℃时，藜麦麸皮皂苷提取率最高，为0.94%。原因可能是，超临界温度较低时，不能够使得藜麦麸皮皂苷完全被提出，而当超临界温度高于60 ℃后，温度过高后，导致藜麦麸皮皂苷有损失，结构发生变化，从而提取率下降，皂苷从燕麦麸皮植物细胞释放出来需要最适的温度[12-13]，综合考虑生产效率，选择超临界温度为55、60、65 ℃为响应面研究水平。

2.1.3 萃取时间对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

萃取时间对藜麦麸皮皂苷提取率的影响见图3。

图3 萃取时间对藜麦麸皮皂苷提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of quinoa bran saponins

由图3 可知，当萃取时间为70 min 时，藜麦麸皮皂苷提取率最低，随着萃取时间的延长，藜麦麸皮皂苷提取率迅速升高，当萃取时间达到90 min 时，藜麦麸皮皂苷提取率达到0.94%，超过90 min 后，几乎不再变化，因此，选择萃取时间为80、90、100 min 为响应面研究水平。

2.1.4 乙醇浓度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响

乙醇浓度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响见图4。

图4 乙醇浓度对藜麦麸皮皂苷提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of quinoa bran saponins

由图4 可知，当乙醇浓度为60%时，藜麦麸皮皂苷提取率最低，随着乙醇浓度的变大，藜麦麸皮皂苷提取率先升高后降低，当乙醇浓度为70%时，藜麦麸皮皂苷提取率最高，为0.94%。原因可能是，乙醇浓度较小时，不能够使得藜麦麸皮皂苷完全被提出，皂苷提取需要最适合的乙醇浓度作为夹带剂[14]，综合考虑生产效率，选择乙醇浓度为65%、70%、75%为响应面研究水平。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 数学模型的建立与显著性检验

由单因素结果，利用软件进一步优化工艺参数。考察超临界压力（A）、超临界温度（B）、萃取时间（C）、乙醇浓度（D）对藜麦麸皮皂苷提取率（Y）的影响，试验设计方案及结果见表2。

表2 Box-Benhnken 的中心组合试验设计及结果Table 2 The central composite experimental design and results of Box-Benhnken

续表2 Box-Benhnken 的中心组合试验设计及结果Continue table 2 The central composite experimental design and results of Box-Benhnken

采用Design-Expert 8.0.6 软件对表2 数据进行统计分析、方差分析及显著性检验，得到以藜麦麸皮皂苷提取率为目标函数，关于各因素编码值的二次回归方程为：Y=0.95+0.036A+0.014B+0.018C+0.009D+0.020AB+0.035AC+0.012AD+0.005BC-0.028BD-0.008CD-0.065A2－0.055B2－0.037C2－0.005D2。对数据进行显著性检验，方差结果见表3，可信度结果见表4。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

续表3 回归方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回归模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

由表3、表4 可知，此模型P 值小于0.000 1，远小于0.01，能够得出此模型极显著，失拟项P 值为0.132 9，不显著，误差很小，故能够用此模型代替真实值对燕麦麸皮皂苷做出分析，复相关系数R2=96.77%，修正相关系数R2Adj=93.53%，Y 的变异系数=1.54%，试验值与理论值相关性高，此模型可靠性高。在回归模型中，一次项A 超临界压力、B 超临界温度、C 萃取时间，交互项A 超临界压力C 萃取时间、B 超临界温度D 乙醇浓度，二次项A2超临界压力、B2超临界温度、C2萃取时间、D2乙醇浓度，对超临界CO2萃取技术提取藜麦麸皮皂苷工艺参数影响均极显著（P＜0.01），一次项D 乙醇浓度、交互项A 超临界压力B 超临界温度，对超临界CO2萃取技术提取藜麦麸皮皂苷工艺参数影响显著（P＜0.05）。方差分析结果表明，影响超临界CO2萃取技术提取藜麦麸皮皂苷工艺参数因素大小依次为A超临界压力＞C 萃取时间＞B 超临界温度＞D 乙醇浓度。

2.2.2 响应曲面和等高线图分析

响应曲面和等高线图见图5。

响应面图能够反映出各个因素之间的相互关系以及相互作用程度[15-16]。通过图5 分析可知，等高线能够更清晰直观反映两因素之间关系。椭圆形表示两因素之间影响极显著，圆形表示因素间影响不显著。超临界压力（A）与超临界温度（B）之间、超临界压力（A）与萃取时间（C）之间、超临界温度（B）与乙醇浓度（D）之间均为椭圆形，对超临界CO2萃取技术提取藜麦麸皮皂苷工艺参数影响极显著。

图5 响应面及等高线图Fig.5 Response surfaces and contour plots

2.2.3 最优条件的优化与验证

为确定最佳参数，对拟合的回归方程分别求一阶偏导数，并设其为0，得到四元一次方程如下：

求解得：A＝0.364、B＝0.084、C＝0.569、D＝0.739，即最佳参数为超临界压力36.82 MPa，超临界温度60.42℃，萃取时间95.69 min，乙醇浓度73.70%，在此条件下，藜麦麸皮皂苷提取率为0.96%。考虑到实际方便及易操作性，将工艺参数优化为：超临界压力37 MPa，超临界温度60 ℃，萃取时间96 min，乙醇浓度74%，在此工艺参数下做3 次平行试验，3 次试验的藜麦麸皮皂苷提取率0.96%。

3 结论

藜麦麸皮是藜麦生产加工过程中所产生的副产物，为了提高藜麦麸附加值，研究采用藜麦麸皮为主要原料，利用超临界CO2萃取技术对藜麦麸皮皂苷进行提取，并采用响应面法对提取工艺参数进行优化。结果表明，最佳工艺参数为超临界压力37 MPa，超临界温度60 ℃，萃取时间96 min，乙醇浓度74%，在此条件下，藜麦麸皮皂苷提取率为0.96%。影响藜麦麸皮皂苷提取率因素由大到小依次为超临界压力＞萃取时间＞超临界温度＞乙醇浓度。