动物源性食品中β-受体激动剂分类及检测方法研究进展

廖艳华

（广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西南宁530028）

β-受体激动剂是一类母核为β-苯乙醇胺结构、具有舒张平滑肌及解除支气管痉挛等作用的药物，在临床上被广泛应用于治疗支气管哮喘。该类药物能结合细胞膜中的β-受体，从而发生一些列生理效应，减少脂肪沉积，提高瘦肉率[1-2]，导致畜禽肉中该类药物残留严重超标。由于β-兴奋剂作用效应较强，并且在动物体内，特别是在动物肝、肾、肺残留量最高，通过食物链进入人体，会使一些易感人群产生较明显的中毒症状，严重危害人类健康[3-4]。为保证动物性食品卫生安全，我国农业部已明令[5-6]克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐、西马特罗及其盐等β-受体激动剂为禁止使用药物，不得在所有动物性食品中检出，并制定了相应的监管制度与检测方法[7-12]。

1 β-受体激动剂种类

β-受体激动剂大多含苯乙醇胺骨架，按苯环取代基不同可分为与胺基、酚羟基、卤素等各种取代基链接；根据胺基上的取代基不同，可分为叔丁基或异丙基类兴奋剂，这有利于β-受体激动剂裂解途径及机理分析、其二级质谱丰富的特征离子碎片信息更有利于目标物的筛查、确证。在国内最常用的有克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林等。

β-受体激动剂化学结构见图1。

图1 β-受体激动剂化学结构Fig.1 Molecular structural of β-agonist

β-受体激动剂常见种类及特征基团见表1。

2 β-受体激动剂的检验方法

β-受体激动剂的检测方法包括依据其不同样品基质前处理方法和检测仪器的不同，目前已建立了液相色谱、酶联免疫法、气相色谱串联质谱法（gas chromatography-mass spectrometer，GC/MS）、液相色谱串联质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrometer HPLC-MS/MS），由单组分检测逐渐向多组分同时检测发展，灵敏度也逐步提高。

表1 β-受体激动剂常见种类及特征基团Table 1 Common species and characteristic groupsof β-agonist

2.1 高效液相色谱法

目前现行有效的国家标准方法GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》[12]第一法为液相色谱法，此法仅为单个组分克伦特罗的检测，试样剪碎后用高氯酸匀浆，进行超声加热提取后，用异丙醇 ∶乙酸乙酯=40 ∶60（v/v）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇∶氨=98 ∶2（v/v）溶液洗脱，洗脱液经流动相定容后在高效液相色谱仪上紫外检测器进行测定，外标法定量，检出限为0.5 ug/kg。王烁等[13]建立了超高效液相色谱测定猪组织中4 种β-兴奋剂（奥西那林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺）的方法，流动相采用乙腈和0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液的梯度洗脱，检测波长为227 nm，外标法定量，4 种兴奋剂的检出限为 0.1 μg/kg～0.4 μg/kg，不同加标水平回收率为61.2%～101.3%，相对标准偏差分别为2.9%～9.2%，此法在分离能力、分析速度及灵敏度方面都比高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）有较大提高，二极管阵列检测器（photo-diode array，PDA）可以提供 190 nm～400 nm 波长的吸收曲线图，在保留时间定性基础上再结合标准物质与样品中待测物吸收曲线匹配度定性。但高效液相法依然存在灵敏度低、无法同时进行多种兴奋剂的测定等缺点，而且存在较多杂质干扰，给定性确证带来困难，因此在近些年应用得很少。

2.2 免疫分析法

免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础检测各种物质的分析方法，由于免疫法选择性较好，具有前处理简单、灵敏度高等优点，故在快速筛查大批量样品中兽药残留方面有广泛应用，免疫分析法中最常用的是酶免疫分析法和胶体金免疫层析法。

酶免疫分析法其原理是待测样品中的β-受体激动剂类药物残留与微孔包被的抗原共同竞争特异性抗体。万宇平等[14]应用直接竞争酶联免疫吸附技术，建立了一种快速检测动物组织中β-兴奋剂类药物多残留的方法，并对其技术性能进行了评价。结果表明，该方法的IC50动范围为0.4 μg/L～0.7 μg/L，对组织样本的检测限为0.5 μg/kg；样本添加回收率为72.9%～103.5%，变异系数为5.8%～14.1%；可用于检测克仑特罗、沙丁胺醇等8 种β-受体激动剂。张璐琪等[15]用比较了3 种不同公司生产的试剂盒测定3 种β-兴奋剂残留，结果显示盐酸克伦特罗试剂盒和莱克多巴胺试剂盒的检出结果与液质法的符合率较高，均为94%；沙丁胺醇试剂盒和β-兴奋剂试剂盒的符合率一般，分别为76.2%和75%，主要表现在假阳性结果较多。龚倩等[16]建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4 种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫（alpha LISA）分析方法，沙丁胺醇与克伦特罗、溴布特罗和特布他林的交叉反应率分别为143.3%、179.2%和95.6%，检出限为0.03 ng/mL～0.08 ng/mL，在 0.5、10、20 μg/kg 3 个添加水平下，4 种化合物的平均回收率为82.5%～15.9%，相对标准偏差均小于12.0%。

胶体金免疫层析法是一种利用胶体金颗粒作为标记物简单快速的免疫分析方法[17]。其最关键的是制备出特异性强和纯度高的单克隆抗体，使用原理是将人工合成的抗原先固定于条状纤维层析材料的试纸条上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，样品溶液借助毛细作用在试纸条上移动，待测物与人工合成的抗原竞争结合胶体金标记的抗体，并直接以颜色显示检测结果。目前主要用在液体样品检测中，在肉制品中应用不多，其灵敏度和准确度不及酶联免疫法。

现行有效标准免疫方分析法[18-19]主要是饲料和动物尿液中受体激动剂的酶联免疫试剂盒方法。GB/T 5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》第三法为酶联免疫法。

虽然免疫法操作简单，使用成本不高，在监测检测中能快速测量大批量样品，但免疫学存在交叉反应现象仍然是制约其应用的主要问题，而且受厂家生产试剂质量影响，有可能抗体批次不同，测定结果也会出现差异。另外在同类药物多残留检测方法方面也有其不能所及之处，不能用于国家相关执法仲裁检验。

2.3 色谱质谱联用技术

色谱联用技术即两种或两种以上的分析技术联合应用，以达到更好的分析效果。色谱质谱联用技术一方面具有色谱的分离能力、分析速度和灵敏度，又兼具质谱对化合物的结构的定性能力，因而在检测的选择性和准确度上都有更好表现。色质联用技术是目前分析β-受体激动剂残留的主流方法，包括气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）和液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）。我国现行检验方式依据不同样品基质前处理方法及检测仪器制定，对 GC-MS[10，12]和 HPLC-MS[7，8，9，11]检测方法做了相关规定和阐述。

受体激动剂的GC/MS 分析与其他分析方法不同主要是样品需衍生化，因为β-受体激动剂属于高沸点、难挥发的极性化合物，不适合直接进行GC 或GCMS 分析。通过衍生化，不仅可以增大试样的挥发性和稳定性，减小样品的极性，还可以达到改善分析效果、提高灵敏度的目的。衍生反应的类型目前文献报道的主要有3 类：第一类为酰化反应，衍生剂通常为七氟乙酰酐、乙酸酐；第二类为甲基硼酸或丁基硼酸化反应，利用β-受体激动剂结构的侧链上有-OH 和-NH-与衍生试剂形成五元环，由于硼的同位素为很强，故其衍生物的质谱峰很有特征性。第三类采用硅烷化反应，衍生剂通常为双三甲基硅基三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）+1 %（φ）三甲基氯硅烷（trimethyl chlorosilane，TMCS）衍生，最后一种是最常用的衍生剂。报道的相关文献[20-23]和标准方法[10，12]GC-MS 样品前处理大多都是样品经过酶解或酸解之后，用pH5.2 的乙酸钠缓冲溶液或酸性甲醇或高氯酸溶液提取样品中的兽药残留，经高氯酸沉淀蛋白后，碱性条件下经过乙酸乙酯 ∶异丙醇（60 ∶40，v/v）进一步提取净化、浓缩，在pH5.2 缓冲体系下经固相萃取柱净化，最后衍生经GC-MS 内标法定量测定；刘五一等[24]用气质法测定畜禽肉中4 种β-兴奋剂的前处理新技术进行研究，结果表明直接用5%的高氯酸提取，WCX 阳离子交换固相萃取小柱效果最佳，检测的4 种兴奋剂在 50 μg/L～1 000 μg/L 的范围具有良好线性，加标回收率在84.32 %～103.15 %之间，RSD 在1.35%～4.78%之间。岳韩笑等[25]采用同位素稀释质谱法，结合HLB-MCX 双柱固相萃取技术，建立了猪肉中克伦特罗、妥布特罗、溴布特罗、沙丁胺醇等4 种β-受体激动剂残留量的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测方法，方法最低检测限为0.13 μg/kg～0.40 μg/kg，最低定量限为0.40 μg/kg～1.27 μg/kg。由于这种方法衍生耗时长，条件不好控制，同时能检测的受体激动剂不是很多，因此方法的使用在逐年减少。

相比于GC-MS、HPLC-MS/MS 的前处理相对简单，不需要经过衍生化步骤，因此国内得到快速普及，现行主流的适用于动物源性β-食品受体激动剂的LC/MS/MS 国家标准分析方法只要有3 个，分别是GB/T 21313-2007 《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》、农业部1025 号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》、GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》。

表2 3 种现行β-受体激动剂国家标准检验方法比较Table 2 Comparison of national standard methods of 3 β-agonist

表2 列举了3 种国家标准检验方法的检验步骤及定量方式对比发现，3 种方法的标准分析方法各有优缺点，GB/T 21313-2007《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》的检验方法能测定8 种β-受体激动剂，提取液不用调节pH 值可直接净化，但是本法需经双柱净化，两次溶剂挥干，检测成本高，过程耗时；基质外标法定量检测结果受检验人员操作影响较大；不同类型的食品其基质效应也不一样，针对分析样品的基质还需配制不同基质标准曲线，增大了检验工作量；农业部1025 号公告-18-2008 检验方法能测定9 种β-受体激动剂中，用一步液液萃取代替固相萃取净化，虽然节省检测成本，但需调节pH 值，人员劳动强度增大，大量溶剂的挥干容易对环境产生污染，同样也存在基质外标法定量无法准确等缺点；GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》检验方法能测定11 种β-受体激动剂，采用基质内标稀释法定量模式，能减少因为样品提取、质谱进样和离子化等多因素造成的差异，定量结果更准确，但液液提取时用的提取溶剂为异丙醇∶乙酸乙酯=60 ∶40（v/v），由于异丙醇在提取液中的比例高、沸点高，其在挥干中需要耗费大量时间，如完全按国标方法操作，异丙醇 ∶乙酸乙酯=60 ∶40（v/v）挥干至少需要 4 h，这给检测过程造成了很大的困扰。

近些年对于液质联用法检测β-受体激动剂，大多学者研究的方向集中在样品的前处理技术与仪器多残留检测技术的开发应用上，能同时分析11 种～35 种受体激动剂。前处理研究的重点主要集中在样品水解方式的选择及净化方法的优化上。贾玉珠等[26]和蔡增轩[27]建立了超高效液相色谱一电喷雾串联四极杆质谱法检测动物组织中20 种β-兴奋剂残留，20 种β-兴奋剂残留用3 种同位数内标进行定量。受体激动剂在55 ℃经葡萄糖苷酸酶酶解2 h，此酶解方式较传统或国标37 ℃酶解16 h 节省了很多时间。刘先军等[28]用1 %三氯乙酸溶液超声提取15 min 动物组织中26 种β-受体激动剂，认为此酸水解的方式起到了水解轭合物的作用，同时具有提取待测物、沉淀蛋白蛋白功能，相对酶解方比较，减少了酶水解中酶制剂本身及其酶解产物对目标物的干扰，满足快速检测化的要求。净化方式优化研究方向主要集中在固相萃取技术上，张瑞雨等[29]优化了样品前处理方法，应用于高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法检测猪肉、猪肝中莱克多巴胺、沙丁胺醇β-受体激动剂。沙丁胺醇和莱克多巴胺的检出限分别为0.13、0.14 μg/kg，在不同基质浓度下的相对标准偏差分别为5.9%～16.2%和6.4%～20.2%。该方法与GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》的预处理方法比较，使用盐酸代替高氯酸调节pH2.0，达到沉淀蛋白与样品过柱净化前调节pH 值双重效果，净化样品时减少了有机溶剂的使用，用价格稍低的SCX 净化柱代替MCX 净化柱，洗脱液用5%氨化乙酸乙酯代替5%氨化甲醇，节约了成本，提高了检验效率，减少了工作量。马俊美等[30]建立在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂的全自动分析方法，样品经MCX在线固相萃取小柱净化，XBridge C18色谱柱分离，检出限为 0.004 μg/kg～0.040 μg/kg；方法回收率为 76.5%～107.7%，在线固相萃取提高了样品的自动化程序，保证了方法重现性，提高工作效率。

除了传统的液液萃取与离子交换固相萃取的净化模式，张学亮等[31]建立了一种分子印迹固相萃取－超高效液相色谱－串联质谱同时测定猪肉中5 种β－受体激动剂残留的方法，检出限为 0.005 μg/kg～0.009 μg/kg，添加水平为 0.25、1、5 μg/kg 时，回收率为 80.4%～92.9%，相对标准偏差为1.2%～6.3%。史娜等[32]建立MPI 固相萃取-同位素稀释法-高效液相色谱串联质谱测定动物源性食品中35 种β-受体激动剂和11 种β-受体阻断剂残留的方法，前处理方法大多与GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》雷同，不同之处是液液萃取的异丙醇 ∶乙酸乙酯比例为 1 ∶1（v/v），用 MPI 固相萃取代替MCX 固相萃取，由于检测数目较多，用的内标多达10 种，保证了结果的准确性。罗辉泰等[33]建立了分散固相萃取-同位素稀释-高效液相色谱-串联质谱（dSPE-ID-HPLC-MS/MS）同时测定猪肉中26 种β-受体激动剂残留的方法，样品经酶解、乙酸铵缓冲液提取、高氯酸沉淀蛋白、离心后，调节pH9.0，乙腈反萃取后经净化上机测定。检出限分别为0.03 μg/kg～0.1 μg/kg，在3 个不同浓度的添加水平下，平均回收率为65.3%～108.5%，相对标准偏差为2.7%～13.3%，通过同位素内标进行校正后其回收率能满足残留分析检测要求，该方法成本低，不用经过复杂的固相萃取步骤，大大缩短了样品前处理时间。李磊等[34]建立QuEChERS EMR-Lipid 为前处理技术测定动物源性食品中8 种β-受体激动剂，样品经酶解、离心处理后，先后经过增强型脂质快速净化管（QuEChERS EMR-Lipid）、脂质净化反萃取管（QuEChERS Final Polish EMRLipid）净化后上LC-MS/MS 分析测定，8 种组分的检出限范围为0.2 μg/kg～0.4 μg/kg，加标回收率为 79.1%～94.8%。

近年来随着检测仪器的发展，基于高分辨质谱可以测定化合物的精确相对分子量，对样品进行高灵敏度、高质量精度的全扫描分析，对复杂样品中目标化合物的检测具有明显优势。因此成为近年动物源性食品中高通量兽药残留筛查与确证研究的热点，刘畅等[35]建立猪肉中31 种β-受体激动剂的高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS）检测方法，31 种化合物的检出限为 0.01 μg/kg～5 μg/kg，结合自建的精确相对分子质量数据库，通过比较精确相对分子质量、保留时间、同位素峰以及特征碎片离子等信息，进行筛选检测，适合于动物源性食品中可能存在的β-受体激动剂的筛查。

2.4 其他检测方法

激动剂其他检测方法还有毛细管电泳法[36]、生物传感器法，但这些方法目前不是特别的完善法，实际工作中很少用到，存在各自的缺点，需要进一步研究。

3 结论

通过研究发现，HPLC-MS/MS 依然是动物源性食品中定性定量分析检测的主要手段，但由于不同食品基质的复杂，前处理步骤多、耗时长以及分析存在较强基质效应的影响，其方法灵敏度、精密度及基质效应的大小受技术人员操作影响较大，因此，对于β-激动剂的残留检测，仍需从4 个方面着手：1、加快现行国家标准的整合、补充和完善。由于现行的多个国家标准检验方法存在着部分交叉、重合，涉及的检测项目种类为19 种，也没有完全涵盖国家相关法规或制度所罗列的全部项目，无法保证相关法规的有效实施；2、为了满足食品安全风险监测检测技术高通量、快速化分析技术要求，待测物提取和净化步骤的改进依然是未来今年研究热点，因此认为未来更有效、更简化的净化模式是前处理研究的重点，其中最能实现该目标的前处理方法认为是QUEChERS 和SPE 技术，这两种技术的优势都包括低试剂消耗及高通量，虽然QUECh－ERS 技术主要针对提取液中的杂质，净化效果不及传统SPE，但笔者认为它在低试剂消耗、高通量的多残留筛查方面仍有明显优势。3、三重四极杆质谱有很高的灵敏度，很好的线性范围，对于监控目标物是非常有效的利器。但是近些年，发生食品安全问题的往往是那些不在监控清单中的物质，食品安全未知物监控领域将是未来的技术发展方向，因此更有效的质谱扫描模式及其分析软件、飞行时间和轨道阱等高分辨质谱对低残留样品的定性定量、多残留筛查以及物质精确质量数的测定和化合物结构研究方向方面提供更为有力的检测工具。4、由于精密仪器价格昂贵、试剂耗材用量大、检测过程复杂、技术要求高、检测时间长等因素，因此建立特异性强、灵敏度高免疫分析快速筛查方法可有效提高检验效率，在现场监控和大规模筛选检测中仍有广阔的应用前景。