银杏叶提取物保护顺铂致小鼠HEI-OC1细胞损伤的作用及机制研究*

雷文静 陆菲 米文娟 查定军

顺铂是临床常用抗肿瘤的一线化疗药物，但其具有耳毒性，它能够引起螺旋神经节的退变，导致内耳毛细胞的广泛损伤[1]。如何预防和减轻顺铂的耳毒性已成为临床研究的热点。黄酮类化合物是最早被发现存在于植物根叶中的天然物，其具有显著的清除氧自由基、抗氧化、抗炎、调节免疫反应等作用；银杏叶提取物(ginkgo biloba extract，GBE)中的黄酮含量较高，其已被提取并在临床中应用[2,3]。然而银杏叶提取物对顺铂引起的小鼠耳蜗毛细胞损伤的保护作用以及潜在的作用机制目前尚未阐明，鉴于此，本研究采用银杏叶提取物对顺铂诱导的致小鼠耳蜗毛细胞(HEI-OC1细胞)损伤进行干预，探讨银杏叶提取物在预防和改善顺铂诱导HEI-OC1细胞损伤中的作用及潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞、主要试剂与仪器 耳蜗毛细胞系(HEI-OC1)为美国豪斯耳科学院Federico教授馈赠，保存于空军军医大学西京医院耳鼻喉研究所。高糖DMEM培养基、进口胎牛血清购自美国Gibco公司； 银杏叶提取物EGB761购自德国威玛舒培博士药厂；细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司；Western blot试剂盒购自碧云天生物公司；超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；二氧化碳培养箱、酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2研究方法

1.2.1细胞培养 取出冻存的HEI-OC1细胞，将其复苏后，置于高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)中，HEI-OC1细胞在37 ℃下容易分化，培养基中不含有抗生素，因此将其培养在33 ℃、10%二氧化碳条件下的培养箱中，采用六孔板进行培养，每隔2～3天换液一次，当细胞密度接近85%时，以1∶1的比例传代。

1.2.2顺铂诱导小鼠HEI-OC1细胞毒性模型制备及实验分组 将处于对数生长期的HEI-OC1细胞进行消化，采用0.25%胰蛋白酶消化2分钟，吹打后置于无菌离心管中，添加高糖DMEM培养基调整细胞密度到1×104/ml，将其加入6孔板中，每孔2 ml。将细胞分为3组，即对照组(control)、顺铂组(cisplatin)、顺铂+银杏叶组(Cis+GBE)，对照组的HEI-OC1细胞中不加入任何药物进行干预，仅在DMEM培养基中培养24小时；顺铂组细胞中加入含有8 μg/ml顺铂的DMEM培养基进行干预24小时； 顺铂+银杏叶组预先给予HEI-OC1细胞加入含有50 μg/ml银杏叶提取物的DMEM培养基作用24小时，倒掉上清并采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2遍后给予含有8 μg/ml顺铂的DMEM培养基作用24小时。含8 μg/ml顺铂的DMEM培养基的配置：取0.8 mg顺铂粉末将其溶入100 ml DMEM培养基中搅拌均匀。含有50 μg/ml银杏叶提取物的DMEM培养基的配置：取5 mg银杏叶提取物粉末将其溶入100 ml DMEM培养基中搅拌均匀。

1.2.3HEI-OC1细胞增殖活性检测 采用CCK-8试剂盒对三组HEI-OC1细胞的增殖活性进行检测，将三组不同干预后的细胞制成细胞悬液，浓度为1×104/ml，将其接种于96孔板中，每孔为100 μl，在培养24、48、72和96 h时分别加入10 μl的CCK-8试剂，孵育2小时后采用酶标仪检测每孔的吸光度值，设定在450 nm处检测；根据吸光度值，绘制细胞的增殖曲线。

1.2.4流式细胞术检测HEI-OC1细胞凋亡 采用FITC标记的Annexin V与碘化丙啶(PI)双染法进行检测，根据凋亡试剂盒说明书进行操作，检测三组HEI-OC1细胞不同干预处理后凋亡情况。

1.2.5HEI-OC1细胞氧化应激指标的检测 检测三组HEI-OC1细胞不同干预处理后的氧化应激水平，包括：SOD、CAT、GSH-Px三个指标代表细胞内抗氧化应激水平，而MDA代表细胞内氧化应激水平。采用SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒进行检测，消化收集三组细胞并制成细胞悬液，采用超声破碎仪进行破碎，以3 000 rpm/min条件离心15 min后去上清用于检测，根据试剂盒说明书进行操作，最后在酶标仪上进行读数并计算。

1.2.6Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及AMPK/SIRT1信号通路表达 取三组干预后的细胞，消化收集并加入蛋白酶裂解液，超声破碎1 min，在4 ℃，13 000 rpm/min条件下离心30 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。采用Western blot试剂盒配置浓缩胶和分离胶，采用SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白进行分离，并采用湿转法将蛋白转膜至PVDF膜上，后采用1%牛血清白蛋白封闭30分钟后，按比例稀释加入一抗，孵育12小时后，加入相应的二抗室温孵育2小时，在ECL发光液作用下显影后观察拍照。根据Western blot曝光拍照的条带，采用image J软件进行分析，识别灰度值，并与内参条带进行对比，计算各个蛋白的相对表达水平。

1.3统计学方法 所有数据利用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差的形式表示，三组比较采用方差分析，两两比较采用LSD法；设定P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组细胞增殖能力比较 三组细胞的增殖能力如图1所示，可见顺铂组、顺铂+银杏叶组HEI-OC1细胞增殖能力明显低于对照组，在第48、72和96 h时，三组细胞增殖能力差异有统计学意义(P<0.05)，而顺铂+银杏叶组的HEI-OC1细胞增殖能力在48、72、96 h时均高于顺铂组(均为P<0.05)，且对照组与顺铂+银杏叶组在第72和96 h时差异无统计学意义(P>0.05)，表明银杏叶提取物干预后，能够改善顺铂诱导的HEI-OC1细胞损伤。

图1 三组细胞增殖能力比较 注:∗三组比较,P<0.05

2.2三组HEI-OC1细胞凋亡率比较 三组HEI-OC1细胞经过不同干预处理后的凋亡情况检测见图2，对照组细胞凋亡率为2.3%±0.2%，显著低于顺铂组的26.8%±4.3%及顺铂+银杏叶组的7.2%±1.5%(P<0.05)，尽管顺铂+银杏叶组的HEI-OC1细胞的凋亡率较顺铂组已有显著的下降，但仍然略高于对照组(P<0.05)。

图2 三组HEI-OC1细胞凋亡率比较 a.对照组;b.顺铂组;c.顺铂+银杏叶组;d.凋亡率比较

2.3三组HEI-OC1细胞氧化应激水平比较 三组HEI-OC1细胞氧化应激水平比较，可见对照组HEI-OC1细胞SOD、CAT、GSH-px水平分别为14.3±2.3 mmoL/mg、18.5±2.5 U/mg、14.2±1.7 μmoL/mg，均显著高于顺铂组(P<0.05)，但对照组与顺铂+银杏叶组在CAT和GSH-px方面差异并无统计学意义(P>0.05)；而顺铂组的MDA水平显著高于其余两组，分别为对照组和顺铂+银杏叶组的2.9倍和2倍(P<0.05)(图3)。

2.4三组细胞凋亡相关蛋白及AMPK/SIRT1信号通路表达 三组细胞凋亡相关蛋白及AMPK/SIRT1信号通路蛋白条带及相对表达量见图4、5。顺铂组的凋亡蛋白Bax和Caspase-3水平较顺铂+银杏叶组显著升高(P<0.05)，而抗凋亡蛋白水平则显著低于顺铂+银杏叶组(P<0.05)。顺铂+银杏叶组的p-AMPK和Sirt1的相对水平则显著高于顺铂组(P<0.05)；但其p-AMPK水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 三组HEI-OC1细胞氧化应激水平比较 注:∗与对照组相比,P<0.05;#与顺铂组相比,P<0.05

图4 三组细胞凋亡相关蛋白及AMPK/SIRT1信号通路蛋白条带

图5 三组细胞凋亡相关蛋白及AMPK/SIRT1信号通路蛋白相对表达量

3 讨论

顺铂用于抗肿瘤治疗中常引起明显的副作用，如：肾毒性和耳毒性[4～7]，顺铂引起的耳毒性常表现为双侧、进行性和不可逆的感音神经性听力损失，严重影响患者的生活质量，其产生耳毒性的比例高达93%[8，9]。如何减少和预防顺铂引起的耳毒性，成为了临床与基础研究的热点。

顺铂引起细胞损伤的机制是其与DNA结合而引起细胞的凋亡，激活炎症级联反应、在细胞中产生氧化应激反应等；其诱导的氧化应激反应则是通过活性氧物质形成过氧化氢或与一氧化氮反应，导致过氧亚硝酸盐形成[10]；研究显示顺铂在体内能够造成小鼠耳蜗毛细胞凋亡增加，外毛细胞缺失[11]。对斑马鱼侧线毛细胞进行研究显示，顺铂可引起斑马鱼侧线毛细胞90%丢失，长时程成像结果显示毛细胞在死亡过程中会出现逐渐固缩的现象，毛细胞细胞核断裂[12]；表明顺铂能够对多种类型动物的毛细胞造成损伤。

银杏叶提取物主要包含有萜内酯和黄酮苷[13,14]，具有抗氧化和清除氧自由基的作用。离体实验证实银杏叶提取物能够清除缺血再灌注心肌组织中的氧自由基和降低氧化应激水平[15]。还有实验证实银杏黄酮能够抑制巨噬细胞的NO合酶水平，降低氧化应激水平[16]。鉴于此，本研究将银杏叶提取物在体外用于预防顺铂引起的HEI-OC1细胞毒性。

本研究所采用的细胞是耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞，它具有一定的永生化能力，在毛细胞的机制等研究中被广泛应用。体内原代提取的毛细胞在体外的增殖能力有限，培养条件要求苛刻，无法满足体外研究的需要。从本研究结果看顺铂干预后小鼠HEI-OC1细胞的增殖能力显著下降，但经过银杏叶提取物干预后其增殖能力有所改善；同时，顺铂引起HEI-OC1细胞的凋亡比率高达26.8%±4.3%，而顺铂+银杏叶组的HEI-OC1细胞凋亡率明显下降，仅为7.2%±1.5%，且氧化应激方面的检测也显示银杏叶提取物能够改善顺铂引起的细胞氧化应激水平过高的状态，减轻氧化应激。本研究对银杏叶提取物保护HEI-OC1细胞抗顺铂损伤的机制研究显示，给予顺铂后，小鼠HEI-OC1细胞中的AMPK/SIRT1的表达水平较对照组细胞显著减少，而再采用银杏叶提取物干预后其HEI-OC1细胞的AMPK/SIRT1的表达水平则显著升高，表明银杏叶提取物可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路进而降低HEI-OC1细胞的氧化应激水平，提高细胞活性，改善凋亡。AMPK广泛存在于真核细胞中，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够调节能量代谢、细胞稳态及氧化应激水平；SIRT1是AMPK下游的效应蛋白，也与细胞的氧化应激调节、能量代谢密切相关。多种体内及体外实验也证实SIRT1的激活能够减轻细胞炎症反应、改善脑缺血后的炎症反应水平[17,18]。

综上所述，本研究证明了顺铂对体外培养的HEI-OC1细胞具有损伤和诱导凋亡的作用，而银杏叶提取物能够通过激活AMPK/SIRT1信号通路进而改善顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡，降低氧化应激水平，改善顺铂引起的耳毒性损伤。