组培复幼对珠美海棠生理及组织结构的影响

郜伟，周文丽，崔瑞瑞，杨松林，高英

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300384）

复幼是指将成熟老态的细胞或者器官恢复到幼嫩状态的重要技术手段[1]，植物是否幼嫩对其生长发育等多个方面有着重要的影响，包括植物的生根能力、生长态势、通直生长状态、繁殖能力、以及对恶劣环境的抵抗程度等[1]。通常情况下，植物幼态时期的生根能力和繁殖能力极强，但是随着植物的生长发育，生根能力和繁殖能力会逐渐降低[2]。因此采取一定的科学技术手段对植物进行复幼生长，其对木本植物的繁殖具有重大意义。自1954年人们发现可以诱导常春藤复幼开始，木本植物的复幼技术便受到了极大的关注[3]，科学家在复幼领域开展了大量的研究，对植物器官的表观特征、细胞的显微、亚显微结构、生理代谢变化、基因表达等各个领域都进行了探讨和研究，并取得了一些成果[4-8]。

珠美海棠（Malus zumi）是蔷薇科苹果属植物，具有极强的抗寒能力和耐盐碱性质，同时也具有较强的耐旱性[9-10]，可以在寒冷地区和盐碱地区广泛种植。且树形优美漂亮，是一种经济实用的观赏性树木。同时，珠美海棠与多种苹果品种嫁接，可在大多数的盐碱地区栽培，对于扩大苹果树的栽种面积，提高苹果品质具有极大的意义。本研究通过珠美海棠组培复幼研究，对于提高其繁殖能力和繁殖系数方面具有重要的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以天津农学院实验楼前的成龄珠美海棠为母树，采集半木质化的枝条作为初代组培苗进行复幼组织培养的外植体。采集继代次数为 0（外植体上的叶片）代，1、3、5、7代在培养箱中培养30 d的植株叶片放入自封袋中，并冷冻保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 珠美海棠的组织培养

以 MS培养基为基本培养基，从树龄相同的多年生珠美海棠母树上选取长势相同的当年生枝条的茎尖做为组培的外植体，建立无菌体系。之后进行继代培养，培养基仍以 MS培养基为基本培养基，加入2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，每次继代时间为30 d，每次继代取前一次继代增殖产生的茎段为材料，连续继代7次，观察复幼增殖的情况，并取样进行生理指标的测定和组织结构的观察。

1.2.2 可溶性糖含量的测定

采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[11]，用电子天平精准地称量各代珠美海棠的叶片0.5 g，每种植物叶片各称取3份进行重复，剪碎混匀后分别放入大试管中，每只试管加入15 mL蒸馏水，然后在沸水浴中煮沸20 min后取出冷却，将冷却后的液体过滤倒入100 mL的容量瓶并定容。测量时取1 mL提取液加入蒽酮试剂（50 mL水中缓慢倒入200 mL 98%浓硫酸，待完全冷却后加入0.05 g蒽酮）5 mL，在620 nm波长下用空白调零，测定其吸光度值。

1.2.3 可溶性蛋白的测定

采用考马斯亮蓝法测定叶片中蛋白质的含量[11]。

酶液蛋白质含量（mg/g FW）=C×V/W×a

C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V为提取液总体积（mL）；a为测定所取提取液体积（mL）；W为取样量（g）。

1.2.4 组织结构的观察

利用石蜡切片法进行组织结构的观察。石蜡切片制备按常规方法进行，取材料放入FAA固定液中，固定24 h以上。固定后的材料利用梯度酒精进行逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。之后进行修块，用切片机切片，烘箱烘干，二甲苯脱蜡，梯度酒精逐级复水，进行番红染色6～8 h，蒸馏水漂洗，70%、80%、95%酒精各脱水1 min，固绿染色1 min，95%酒精、无水乙醇、酒精二甲苯混合液各2 min，二甲苯5 min，脱水透明处理。中性树脂胶封片，电子显微镜下观察，并拍照记录不同放大倍数下茎、叶结构图。

1.3 数据处理

利用Excel 2010和SPSS17.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同代数珠美海棠叶片中可溶性蛋白含量的变化

由图1可知，0代珠美海棠中可溶性蛋白含量为0.033 mg/g；1代珠美海棠中可溶性蛋白的量为0.034 mg/g；之后随继代次数的增加，可溶性蛋白含量呈下降趋势，继代培养第7代时珠美海棠中可溶性蛋白的含量最低，为0.027 mg/g。但培养5代之前各代的可溶性蛋白含量差异不显著，第 7代与其他各代相比可以达到显著水平。

图1 复幼后各代珠美海棠叶片中可溶性蛋白含量

2.2 不同代数珠美海棠叶片可溶性糖含量的变化

通过试验对复幼后各代珠美海棠叶片内可溶性糖含量测定，并进行显著性分析，其含量变化如图2所示。从图中可知，0代珠美海棠叶中可溶性糖含量为0.006 8 g/100g；1代珠美海棠叶中可溶性糖含量为0.007 2 g/100g；随继代次数的增加可溶性糖含量逐渐递减，第7代珠美海棠叶中可溶性糖含量为0.006 1 g/100g，达到各代培养的最低水平。分析可知，0代和3代之间没有显著性差异；5代和7代之间没有显著性差异；0代和1代之间具有显著性差异且1代中含量比0代中的含量略有增加。从整体上看，复幼后珠美海棠叶片中的可溶性糖含量呈现减少趋势。

图2 复幼后各代珠美海棠叶片中可溶性糖含量

2.3 不同继代次数组培苗叶片及茎的组织结构比较

2.3.1 不同继代次数组培苗叶片组织结构的变化

图3为不同继代次数珠美海棠组培苗叶片的组织结构横切图。如图3可知，0代、1代栅栏组织明显，1代较0代的栅栏组织减少，3代和5代栅栏组织明显较0代和1代减少，但仍能观察到栅栏组织，7代栅栏组织最少，较难观察。各继代次数叶片海绵组织没有明显变化。0代、1代上表皮细胞排列整齐且细胞壁较厚，3代、5代、7代上下表皮细胞均有增大，表皮细胞壁变薄。维管组织0代叶最发达，随着继代次数的增加，维管束在叶中所占比例减小。

图3 不同继代次数珠美海棠组培苗叶横切面结构图

2.3.2 不同继代次数组培苗茎组织结构的变化

图4为不同继代次数珠美海棠组培苗茎横切面结构图。由图4可以看出，0代茎横切显微结构表皮细胞排列紧密整齐，表皮细胞壁较厚，皮层薄壁细胞小且较少，木质部明显排列紧密整齐，木质化程度较高，韧皮层较宽，髓部细胞形状较规则，髓射线较清晰。1代茎与0代相比，表皮细胞壁变薄，皮层薄壁细胞增多，木质部明显减少且排列疏松，木质化程度降低，韧皮部没有明显变化。3代、5代、7代茎表皮细胞壁变薄，表皮细胞增大，皮层薄壁细胞增大，细胞层增厚，木质部减少，细胞排列疏松，韧皮层稍有减少。髓细胞形状不规则，髓射线不明显。

图4 不同继代次数珠美海棠组培苗茎横切面结构图

3 讨论

3.1 组培复幼对植物叶片中可溶性糖的影响

植物器官内可溶性糖的变化会对植物叶片的生理适应性产生一系列的影响，主要表现在抗寒、抗旱、耐盐碱等对不良环境的抵抗能力等方面[12-15]。复幼后珠美海棠叶片中的可溶性糖经过测定和显著性差异分析可知:0代和 3代间没有显著性差异；0代和1代之间具有极显著性差异，且呈现增加趋势；5代、7代和0代相比具有极显著性差异；5代和7代之间没有显著性差异；从总体上来看，叶片中可溶性糖含量1代与0代相比为增加，而自第3代开始，逐代呈下降趋势。文佳等研究了树龄对油茶叶中可溶性糖的含量变化，表明随着树龄的增加叶片中可溶性糖的含量显著增加[16]，本试验结果表明，珠美海棠叶片内的可溶性糖含量随继代次数的增加而降低，这和前人研究的变化结果相符。但在本试验中复幼第1代珠美海棠叶片中的可溶性糖含量出现一次上升，导致这种情况的具体原因尚不明确，还有待进一步研究。

3.2 组培复幼对植物叶片中可溶性蛋白的影响

植物体内可溶性蛋白的含量与植物的抗寒性有很大的关联，可溶性蛋白的含量和植物抗寒能力强弱呈现正比关系[17]。复幼后各代珠美海棠叶片中的可溶性蛋白含量几乎没有显著性差异，直到复幼到第7代时叶片内的可溶性蛋白才与0代中的可溶性蛋白含量呈现显著性差异。根据本试验的数据推测，复幼对珠美海棠叶片内的可溶性蛋白含量变化影响不大，且变化趋势不明显。也可能是由于本试验中复幼代数较少，未能得出复幼与可溶性蛋白含量变化之间的关系。

3.3 不同继代次数对组培苗组织结构的影响

刁俊明等[7]在研究不同树龄桐花树叶片组织结构时，将叶片海绵组织厚度、栅栏组织厚度、叶面长宽比等作为指标。结果显示，随树龄的增加，叶片的栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片组织结构紧密度均呈先降后升趋势。本试验珠美海棠叶片结构随继代次数的增加栅栏组织逐渐减少，排列逐渐疏松，海绵组织没有明显变化，叶上下表皮细胞有增大趋势，表皮细胞壁变薄。栅栏组织变化与刁俊明试验结果相似，但海绵组织无明显变化。Amissah等[18]在研究茎的结构与生根能力之间的关系时，发现连续的厚壁组织会阻止不定根的发生，而幼态的茎结构中厚壁组织不连续，因此生根能力较高。Ballerster[8]在研究板栗幼龄期和成熟期体外生根过程茎显微结构变化中，幼体和成熟枝条在切除时具有相似的茎结构，主要区别在于木质部和韧皮部在成熟期比幼龄期发育得更好。本试验结果与上述结果趋于一致，0代有较厚的表皮细胞壁，且木质部发达，细胞排列紧密。随继代次数增加表皮细胞壁变薄，木质部排列变疏松。

4 结论

通过本研究可知，随着继代次数的增加，珠美海棠复幼程度呈现逐渐加剧趋势。因此，组培继代培养可以实现苗木复幼的目的，对优质苗木的生产具有较强的指导意义。