延龄草总皂苷调控IL-6/STAT3信号抑制胃癌细胞侵袭和迁移的作用研究

张 刚 余 琼 杜 娟

(江汉大学附属医院武汉市第六医院消化内科,武汉430015)

胃癌是发生于消化系统的恶性肿瘤，其在世界范围内影响着人类的生命健康，胃癌具有转移快、早期发病隐匿等特点，多数患者在发现时已经处于胃癌晚期且已经发生了转移，胃癌转移是胃癌致死的重要原因之一[1]。延龄草属于百合科植物，是传统中药之一，具有延年益寿、祛风活血等作用[2]。最近的研究表明，延龄草总皂苷具有抗肿瘤作用，目前在宫颈癌、结直肠癌等肿瘤细胞中已经验证其具有体外抑制肿瘤细胞生长和转移的作用，延龄草总皂苷对胃癌细胞侵袭和迁移作用尚不明确[3,4]。IL-6/STAT3信号是与肿瘤转移有关的调节因子，IL-6表达上调可以诱导STAT3发生磷酸化，促进肿瘤细胞侵袭、迁移和EMT[5]。我们的实验以明确延龄草总皂苷对胃癌细胞侵袭迁移的作用和机制为目的，为延龄草总皂苷治疗肿瘤的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料 胃癌细胞SGC-7901购自美国ATCC；MMP-2抗体、STAT3抗体、MMP-9抗体购自美国Sigma；延龄草总皂苷由湖北大学中药生物技术实验室提取保存；E-cadherin抗体、IL-6抗体购自美国Abcam；Vimentin抗体、p-STAT3抗体购自美国R&D Systems；IL-6重组慢病毒和阴性对照慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。

1.2方法

1.2.1CCK-8检测延龄草总皂苷对胃癌细胞增殖影响 胃癌细胞经过计数之后按照3 000个/孔接种到96孔板内，将细胞按照0、10、20、40、80、160 mg/L的延龄草总皂苷作用浓度梯度分组，放在培养箱内孵育48 h，取出培养板，添加CCK-8溶液10 μl，在避光中反应2 h。测定酶标仪波长470 nm 的A值。

1.2.2Transwell小室检测延龄草总皂苷对胃癌细胞侵袭和迁移影响 在Transwell小室中添加50 mg/L 的基质胶湿化，置于4℃风干，再添加不含血清的细胞培养液把基底膜水化0.5 h。将小室置于培养板内，分别在上室内加入100 μl的以不含血清且含有延龄草总皂苷浓度为0、10、20 mg/L的细胞培养液悬浮的胃癌细胞，同时分别在下室内加入500 μl含有血清的细胞培养液。继续培养48 h，取棉签把没有穿膜的细胞清除掉，把Transwell小室取出后风干，以0.1%的结晶紫溶液染色30 min，添加PBS洗涤，分别选取5个视野，计算细胞侵袭数目。细胞迁移实验前不用基质胶湿化小室，其余步骤同侵袭实验。

1.2.3Western blot检测延龄草总皂苷对胃癌细胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达影响 取0、10、20 mg/L的延龄草总皂苷处理培养48 h后的胃癌细胞，提取细胞中总蛋白。按照下述方法进行Western blot检测：依照BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度，分别吸取蛋白样品加入到5×Loading Buffer溶液中混合(体积比为4∶1)。将电泳液添加到电泳槽内，以10%的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，每个泳道内蛋白上样量为30 μg，Marker上样量为5 μl，设置80 V的电压进行电泳30 min，再调整电压到120 V继续电泳，直至溴酚蓝染料到达底部之后方可停止电泳。常规半干法转膜，转膜参数为：120 mA，1.5 h。取出NC膜，置于5%牛血清白蛋白封闭液中孵育结合1.5 h。把NC膜取出，再放置于含有一抗的反应液内，在4℃过夜，NC膜与二抗(1∶2 000稀释)反应液在室温中孵育1.5 h，按照ECL发光试剂盒发光，用Quantity One分析各蛋白条带的灰度值，GAPDH作为参照。

1.2.4IL-6慢病毒感染对延龄草总皂苷抗胃癌细胞侵袭、迁移和EMT影响 胃癌细胞按照常规方法感染IL-6重组慢病毒和阴性对照慢病毒，MOI=10，感染后24 h换液，继续培养3 d感染效率高于90%，收集细胞用于后续实验。感染IL-6重组慢病毒和阴性对照慢病毒的胃癌细胞用含有10 mg/L的延龄草总皂苷的细胞培养液培养，记为TST+Lv-IL-6组和TST+Lv-NC组，按照Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力，按照Western blot方法检测细胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平，步骤同上。

2 结果

2.1延龄草总皂苷抑制胃癌细胞增殖 见表1，20、40、80、160 mg/L的延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞增殖能力降低，10 mg/L的延龄草总皂苷对胃癌细胞增殖没有影响。为了消除细胞增殖对胃癌细胞增殖能力的影响，选用10 mg/L和20 mg/L的延龄草总皂苷做后续实验。

2.2延龄草总皂苷对胃癌细胞侵袭和迁移影响 见图1和表2，延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞细胞侵袭和迁移数目均降低，细胞中侵袭迁移相关蛋白MMP-9和MMP-2表达水平均降低。延龄草总皂苷能够体外抑制胃癌细胞侵袭及迁移。

Total saponins oftrillium concentration(mg/L)A57000.76±0.07100.69±0.05200.56±0.041)400.39±0.031)800.27±0.021)1600.20±0.021)F87.303P0.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

2.3延龄草总皂苷对胃癌细胞中EMT标志蛋白E-cadherin、Vimentin表达影响 见图2和表3，延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，Vimentin蛋白表达水平降低。延龄草总皂苷能够体外抑制胃癌细胞EMT。

图1 Western blot检测延龄草总皂苷对胃癌细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达影响Fig.1 Western blot to detect effect of total saponins of trillium on expression of MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cells

Total saponinsof trilliumconcentrationNumberof invasionNumberof migrationMMP-2MMP-90 mg/L105.65±10.69 156.32±13.580.63±0.060.66±0.0710 mg/L80.84±7.121)122.83±10.451)0.46±0.041)0.53±0.051)20 mg/L63.87±6.831)99.21±10.761)0.25±0.031)0.28±0.041)F18.77718.10453.45937.300P0.0000.0030.0000.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

图2 Western blot检测延龄草总皂苷对胃癌细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表达影响Fig.2 Western blot analysis of effect of total saponins of trillium on expression of E-cadherin and Vimentin in gastric cancer cells

2.4延龄草总皂苷对胃癌细胞中IL-6/STAT3信号关键蛋白IL-6、STAT3、p-STAT3表达影响 见图3和表4，延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞细胞中IL-6、p-STAT3蛋白表达水平降低。延龄草总皂苷能够体外抑制胃癌细胞中IL-6/STAT3信号激活。

2.5IL-6过表达慢病毒提高延龄草总皂苷作用条件下胃癌细胞中IL-6/STAT3信号通路激活水平 见图4和表5，IL-6过表达慢病毒感染后的胃癌细胞经过延龄草总皂苷处理后，细胞中IL-6、p-STAT3蛋白表达水平升高。IL-6过表达慢病毒提高延龄草总皂苷条件下胃癌细胞中IL-6/STAT3信号激活水平。

Total saponins of trilliumconcentrationE-cadherinVimentin0 mg/L0.34±0.030.73±0.0910 mg/L0.53±0.061)0.42±0.041)20 mg/L0.68±0.081)0.30±0.031)F23.97341.802P0.0010.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

图3 Western blot检测延龄草总皂苷对胃癌细胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达影响Fig.3 Western blot analysis of effect of total saponins of trillium on expression of IL-6,STAT3 and p-STAT3 in gastric cancer cells

2.6过表达IL-6逆转延龄草总皂苷对胃癌细胞侵袭迁移和EMT影响 见图5和表6，IL-6过表达慢病毒感染后的胃癌细胞经过延龄草总皂苷处理后，细胞侵袭迁移能力升高，MMP-9、MMP-2和Vimentin蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低。过表达IL-6能够逆转延龄草总皂苷对胃癌细胞侵袭迁移和EMT的抑制作用。

Total saponins of trilliumconcentrationIL-6STAT3p-STAT30 mg/L0.86±0.080.70±0.070.58±0.0610 mg/L0.52±0.051)0.71±0.060.39±0.031)20 mg/L0.34±0.041)0.70±0.080.32±0.021)F59.7710.02033.245P0.0000.9800.001

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

图4 Western blot检测IL-6过表达慢病毒载体对延龄草总皂苷影响胃癌细胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达作用Fig.4 Western blot analysis of effect of lentiviral vector over-expressing IL-6 on expression of IL-6,STAT3 and p-STAT3 in gastric cancer cells with total saponins of trilliumNote: 1.TST+Lv-Nc group;2.TST+Lv-IL-6 group.

GroupsIL-6STAT3p-STAT3TST+Lv-NC group0.43±0.040.79±0.080.36±0.03TST+Lv-IL-6 group0.64±0.031)0.80±0.070.54±0.051)t7.2750.163 5.347P0.0020.879 0.006

Note：Compared with TST+Lv-NC,1)P<0.05.

图5 Western blot检测过表达IL-6对延龄草总皂苷影响胃癌细胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表达作用Fig.5 Western blot analysis of effect of IL-6 overexpress-ion on expression of MMP-2,MMP-9,E-cadherin and Vimentin in gastric cancer cells with total saponins of trilliumNote: 1.TST+Lv-Nc group;2.TST+Lv-IL-6 group.

图6 过表达IL-6后经延龄草总皂苷处理的胃癌细胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平和细胞侵袭(A)、迁移(B)数目Fig.6 Expression levels of MMP-2,MMP-9,E-cadherin,Vimentin and number of cell invasion (A) and migration (B) in gastric cancer cells treated with total saponins of trillium after overexpression of IL-6

GroupsNumber of invasion Number of migrationMMP-2MMP-9E-cadherinVimentinTST+Lv-NC group83.65±9.15120.17±11.320.54±0.050.57±0.060.77±0.050.56±0.04TST+Lv-IL-6 group 110.68±11.521)147.25±9.831)0.96±0.101)0.76±0.051)0.50±0.041)0.83±0.081)t3.1823.1296.5074.2147.3045.229P0.0340.0350.0030.0140.0020.006

Note：Compared with TST+Lv-NC,1)P<0.05.

3 讨论

我们发现，延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞的增殖能力降低，细胞侵袭和迁移能力下降，说明延龄草总皂苷具有抗胃癌细胞体外恶性表型的作用，延龄草总皂苷可能是胃癌治疗的有效方法。延龄草属于多年生草本植物，含有黄酮苷、甾体皂苷等多种化学成分，具有解毒、止血等功效，常用于治疗高血压、跌打损伤、头晕目眩等症状[6,7]。近年来的研究报道显示，延龄草还具有凝血、消炎等活性，对于肿瘤具有抑制作用[8]。延龄草总皂苷是提取自中药延龄草中的活性成分，对于肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞具有体外抗生长和抑制转移的作用，延龄草总皂苷处理后的乳腺癌细胞侵袭和迁移能力降低，细胞中侵袭和迁移蛋白MMP-9、MMP-2表达水平降低，延龄草总皂苷可能是肿瘤治疗的有效药物之一[9-11]。我们的实验结果与上述研究报道一致，说明延龄草总皂苷对胃癌细胞的抑制作用与其余肿瘤相同，均具有抑制细胞转移潜能的作用。

本次实验还检测了延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞中EMT相关蛋白表达情况，发现延龄草总皂苷可以抑制间质蛋白Vimentin的表达并促进上皮蛋白E-cadherin的表达，延龄草总皂苷具有抗胃癌细胞EMT的作用。肿瘤细胞EMT与肿瘤的恶性转移呈正相关，并且肿瘤细胞EMT是肿瘤转移的早期标志，EMT的特点为间质标志物表达上调而上皮标志物表达下调[12-16]。我们的实验证实了延龄草总皂苷具有抗胃癌细胞EMT的作用，这为研究延龄草总皂苷抗肿瘤机制提供了新思路。

IL-6/STAT3是与肿瘤有关的信号转导通路，IL-6具有多种生物学功能，其可以由肿瘤细胞等多种细胞产生，通过激活STAT3磷酸化而发挥肿瘤诱导作用[17,18]。在卵巢癌、胃癌、结直肠癌等大多数肿瘤组织中发现，阻断IL-6/STAT3信号转导可以抑制肿瘤细胞的恶性表型，其也是目前肿瘤治疗的有效靶点之一[19-21]。我们的实验结果表明，延龄草总皂苷处理后的胃癌细胞中IL-6蛋白和STAT3磷酸化水平降低，并且通过上调IL-6表达水平激活IL-6/STAT3信号通路可以逆转延龄草总皂苷抗胃癌细胞侵袭迁移和EMT的作用，这说明延龄草总皂苷可以通过抑制IL-6/STAT3信号激活发挥抗胃癌作用。

总而言之，本次实验初步明确了延龄草总皂苷对胃癌细胞的作用和机制，对于不同来源的延龄草总皂苷的敏感性及具体的机制还需要在以后的实验中进行探讨。延龄草总皂苷可能是胃癌治疗的有效途径，并且其作用机制与下调IL-6/STAT3信号激活水平有关，这对于研究延龄草总皂苷抗肿瘤机制具有重要意义。本次实验只在体外进行了初步探讨，后续还需要在体内和多方面进行研究和验证。