南亚实蝇转录组及嗅觉相关基因的初步分析

杜迎刚 季清娥 赖钟雄

摘  要  南亞实蝇Bactrocera tau （Walker），是葫芦科、茄科蔬菜和多种热带、亚热带果树上的主要害虫，抗逆性强，繁殖速度快，防治难度大。为挖掘可用于生物防治的分子靶标和探讨副信息素类引诱剂对其作用的分子基础，本研究采用Illumina HiSeq2500 PE125 bp测序技术对其混合样进行转录组测序和生物信息学分析。经序列拼接获得36 109条Unigenes，进一步与七大公共数据库进行同源比对，注释了21 127条Unigenes，其中在Nr数据库中注释成功的Unigenes数目最多，20 948条。Nr数据库注释的南亚实蝇B. tau Unigenes与地中海实蝇Ceratitis capitata同源性最高，达59.80%;与模式昆虫黑腹果蝇Drosophila melanogaster的同源性次之，达14.86%。将Unigenes与GO数据库比对发现，14 029条Unigenes根据功能分为了3个大类57个亚类;而与KOG数据库比对结果为，13 479个Unigenes基因其功能属于25个类别;进一步KEGG数据库代谢分析表明，6442条Unigenes参与了5大类共152个代谢通路。基因注释进一步筛选鉴定获得了嗅觉相关基因528个，对其中气味结合蛋白基因氨基酸序列的分析表明，其大多为具有6个保守的半胱氨酸位点的典型气味结合蛋白，且与黑腹果蝇D. melanogaster、地中海实蝇C. Capicata、瓜实蝇B. cucuribitae、橘小实蝇B. dorsalis的气味结合蛋白基因具有很高的同源性。这为南亚实蝇对副信息素类引诱剂反应的相关功能基因的挖掘及从嗅觉上寻求科学的防治措施提供了基础数据。

关键词  南亚实蝇;转录组分析;高通量测序;基因注释;嗅觉基因中图分类号  S433      文献标识码  A

Preliminary Analysis of Transcriptome and Olfaction-related Genes in Bactrocera tau（Walker）

DU Yinggang^1，2， JI Qinge³， LAI Zhongxiong^2*

1. Facility Horticulture Laboratory of Universities in Shandong， Weifang University of Science and Technology， Shouguang， Shandong 262700， China; 2. Institute of Subtropical Pomology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract  Bactrocera tau（Walker） is a major pest to Cucurbitaceous and Solanceous vegetables and many fruits of tropical and subtropical areas. Prevention and control of it is very difficult due to its strong resistance and rapid reproduction. To seek effective molecular targets for its control and the action mechanism of parapheromone， transcriptome ofB. tauwas sequenced and related bioinformatics analyzed using Illumina HiSeq2500 PE125 bp sequencing platform. The clean reads were then de novoassembled into 36 109 Unigenes. Through a similarity search against seven public databases， 21 127 unigenes were annotated. Most unigenes were annotated to Nr database with a success number of 20 948， and the unigenes ofB. Tauhad the highest homology to those ofCeratitis capitate in species distribution of unigenes in Nr database （59.80%）， followed by 14.86% withDrosophila melanogaster. According to GO database， 14 029 Unigenes were classified into 3 categories and 57 sub-types， while searching KOG database， 13 479 Unigenes were sorted in 25 functional groups. Metabolic analysis based on KEGG found 6442 Unigenes involved in 152 metabolite pathways in 5 classes. By further screening and identification， 528 olfaction-related genes ofB. tauwere obtained. Analysis of odorant binding protein genes ofB. taudemonstrated that most of them were typical with 6 conserved cysteine sites and with high homology to those ofD. melanogaster，C.capicata，B. cucuribita andB. dorsalis. These results will provid basic information for the research of functional genes related to parapheromone treatment onB. tauas well as the establishment of control measures based on olfactories.

Keywords  Bactrocera tau （Walker）; analysis of transcriptome; high-throughput sequencing; gene annotation; olfaction genes

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.018

南亞实蝇Bactrocera tau （Walker），属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae，果实蝇属Bactrocera Macquart^[1-3]，为害丝瓜、南瓜、苦瓜等13种瓜类，柑桔、芒果等共计70多种热带和亚热带瓜果。中国主要分布于广东、广西、海南、福建、云南、贵州、四川、湖北、浙江、江西等地^[4]。因其抗逆性强，个体食量大，发育历期短，产卵期长，在很多地区其危害甚至超过橘小实蝇B. dorsalis（Hendel）^[5]。

目前，对南亚实蝇的防治措施主要借鉴橘小实蝇B. dorsalis和瓜实蝇B. cucuribitae的4步防控技术^[6-7]，其中性诱灭雄技术[指施用甲基丁香酚（methyl eugenol，简称ME）和诱蝇酮（cuelure，简称CUE）等对相关种类实蝇雄性具有强吸引作用的副信息素进行诱杀而降低雄虫数量]从实蝇防治初期就一直发挥着重要作用^[8]。这2种物质对很多种类实蝇雄性都具有很强的引诱活性，但世界上没有一类昆虫像实蝇科昆虫那样对副信息素类物质的反应存在如此大差异^[9-10]。就南亚实蝇而言，对ME和CUE都有趋性，但ME/CUE对其引诱活性远不如ME对橘小实蝇、CUE对瓜实蝇那样强烈，这就导致了性诱灭雄技术在南亚实蝇上效果非常不理想，近年来，随着高通量测序技术的发展，转录组分析逐渐成为昆虫中寻求新的防治措施的有效手段^[11]。本研究以HiSeq2500高通量测序技术，首次对南亚实蝇进行了转录组测序研究，并以该转录本为依据对其嗅觉基因进行了挖掘，对OBPs进行了进化分析，为南亚实蝇嗅觉机理的探讨和防治方法的寻求提供了重要数据。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  供试虫源及饲养方法  室内大量饲养虫源为福建农林大学益虫研究所2013年建立的室内大量饲养种群，初始种群采自漳州为害丝瓜，本实验用虫为同地点同类寄主上野生虫源连续复壮3次后的虫源;辐照虫源为用95 Gy/100 Gy剂量的⁶⁰Co辐照的羽化前2 d的蛹，羽化后正常人工饲料饲养的虫源^[12];ME/CUE亚剂量诱导虫源为取1 mL纯的ME/CUE均匀涂抹盛在直径60 mm培养皿中的人工饲料表面，于羽化后2 d（性成熟前）、5 d（发育关键日龄）、7 d（交配前）饲喂3次，连续诱导4代的虫源。饲养方法参照文献[13]。

1.1.2  测序样本  正常饲养、辐照处理、CUE/ME诱导的南亚实蝇在1日龄（对ME有触角电位反应，但没趋性^[6]）、5日龄（对ME/CUE开始有趋性反应，但性未成熟）、10日龄（性成熟、交配前后）、17日龄（产卵后）、19日龄（部分实蝇开始出现2次交配）雌雄各取5只，平行取3管，液氮速冻后送至北京百迈客生物科技有限公司进行测序和分析，测序系统为HiSeq2500PE125测序仪。

1.2方法

1.2.1  RNA的提取  样品充分研磨后用Trizol Reagent提取RNA，用Nanodrop分光光度计（德国Implen公司）、Qubit 2.0 荧光定量仪（美国Life Technologies公司）、Agilent 2100系统（美国Agilent Technologies公司）方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性。

1.2.2  文库的构建、测序及数据的拼接、组装  RNA样品检测合格后，按照Preparing Samples for Sequencing of mRNA试剂盒说明书（Illumina）构建测序文库。当库检合格后，用Illumina HiSeq 2500 的PE125 bp双向测序技术对文库进行测序。将测序得到碱基质量打分能达到或超过Q30高质量的Raw data进行数据过滤，去除其中接头序列及低质量Reads，获得高质量的Clean data。然后利用短reads组装软件Trinity将具有重叠区域的Clean data进行序列组装，获得Unigene库。

1.2.3  Unigene功能注释  使用BLAST软件将Unigene序列与NR（Non-redundant protein database，非冗余的蛋白质序列数据库）、Swiss-Prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database，人工注释和审查蛋白质序列数据库）、GO（Gene ontology，基因本体）、COG（Cluster of orthologous groups，蛋白相邻类的聚簇）、KOG（Eukaryotic orthologous groups，真核生物同源组）、Pfam（Pfam database，同源蛋白家族数据库）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）数据库比对，通过基因的相似性进行功能注释。

1.2.4  嗅觉相关基因鉴定分析  根据获得的南亚实蝇转录组数据，对嗅觉系统相关基因进行统计分析。在NCBI、公共数据库中搜索并与已登录的黑腹果蝇D. melanogaster、地中海实蝇C. Capicata、瓜实蝇B. cucuribitae、橘小实蝇B. dorsalis等昆虫的嗅觉相关基因的氨基酸序列进行BLAST比对，其中OBPs、CSPs结合其特有的结构通式^[14-15]进行进一步鉴定。鉴定出来的OBPs用MEGA5.0的Neighbor-joining方法构建进化树，以Bootstrap=1000检验进化树的可靠性。

2  结果与分析

2.1  RNA的提取与检测

总RNA提取完整，OD_260/280为2.09，OD_260/230为0.91，28S/18S为1.4，浓度分别为2873.4 ng/μL，RNA纯度和质量符合后续实验要求。

2.2转录组测序及序列拼接组装

对测序数据进行产出统计，共得到10.97 Gb Clean Data，Q30比例（测序错误率<0.1%）为90.05%（>90%），GC含量为43.58%。说明此样品测序的数据符合要求，可以保证后续序列拼接组装质量。

采用Trinity软件把获得的高质量测序数据进行序列组装，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，得到36 109条Unigenes（表1）。其中N50和平均长度分别为1897和955.14 bp，说明此转录本文库的测序和组装结果较好，能够进行后续生物信息学分析。

2.3  Unigenes的功能注释

使用BLAST软件将36 109条Unigenes与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得Unigene的注释信息。最终获得21 127条有注释信息的Unigenes，占总Uni genes的58.51%，其中在NR数据库中注释成功的Unigenes数目最多，20 948条，占总数的58.01%;其后依次是Swiss-Prot有14 103条（39.06%），GO有14 029條（38.85%），KOG有13 479条（37.33%），Pfam有12 670条（35.09%），KEGG有6442条（17.84%）和COG有5984条（16.57%）（表2）。Unigene注释到NR数据库中的物种分布图显示（图1），地中海实蝇C. capitata最多为13 526条，其后依次为黑 腹果蝇D. melanogaster（3112条）、拟果蝇D. simulans（302条）、果蝇D. sechellia（196条）、中华支睾吸虫Clo nor chis sinensis（192条）、家蚕Bombyx mori（176条）、黑果蝇D. virilis（173条）、非洲果蝇D. yakuba（159条）、罗阿丝虫Loa loa（154条）、南美热带果蝇D. willistoni（153条）;其他物种2718条。

2.4  Unigenes的功能分类

对南亚实蝇转录组的Unigenes进行GO分析发现，在GO注释的14 029条Unigenes中，注释到生物学过程（Biological process）的基因最多（52 151条），其次是分子功能（Molecular functiion）（25 047条），细胞组分（Cellular component）的最少（18 959条）。在57个亚类中，以细胞过程、单生物过程、代谢过程在生物学过程中的比例较高，细胞和细胞部分在细胞组分中所占比例较高，蛋白结合和催化活性在分子功能分类中占有较高比例（图2）。对南亚实蝇的Unigenes基于GO数据库进行功能分类，可以从宏观上认识南亚实蝇基因功能分布特征，为下一步目标基因的挖掘提供了便利。

将组装得到的Unigenes与KOG数据库比对，共有13 479个Unigenes基因被注释，占37.33%，分为25个类别，最多的是一般功能预测基因（1681个），占12.47%;其次，是翻译、核糖体结构与合成基因（711个），占5.27%;第三，是复制、重组和修复基因（629个），占4.67%;第四，是翻译后的修饰、蛋白质转化、伴侣基因（584个），占4.33%;最少的是核酸结构基因（2个），占0.01%，细胞外结构基因（0个）（图3），说明了南亚实蝇Unigenes功能分类的总体情况。

KEGG数据库对南亚实蝇的Unigenes可能参与或涉及的代谢途径进行分析表明，6442个Unigenes参与了细胞过程（cellular processing）、环境信息处理（environmental information processing）、遗传信息处理（genetic information proce ssing）、代谢（metabolism）和生物系统（organismal systems）5大类共152个代谢通路，其中注释基因数最多的10个代谢通路依次为：核糖体（276个）、氧化磷酸化（268个）、内质网蛋白加工（246个）、RNA运输（233个）、嘌呤代谢（181个）、剪接体（174个）、细胞内吞作用（146个）、泛素介导的蛋白质降解（143个）、溶酶体（141个）和吞噬体（133个）（表3）。

2.5嗅觉相关基因分析

通过对7大公共数据库同源比对和注释分析，528个嗅觉相关基因在南亚实蝇转录组中获得鉴定。其中包括34个OBPs、3个化学感受蛋白基因[Chemosensory protein （CSP） genes]、20个嗅觉受体基因[Olfactory receptor （Or） genes]、43个离子型受体基因[Ionotropic receptor （IR） genes]、204个昆虫触角G蛋白基因（GTP binding protein genes）、5个昆虫感觉神经元膜蛋白[Sensory neuron membrane proteins （SNMPs）]基因和219个气味降解酶基因[Odor degrading enzymes （ODE） genes]（表4）。对OBPs的分析发现，28条具有完整的开放阅读框，进一步氨基酸序列分析表明，2条属于Minus-OBPs，1条为Dimer-OBPs，1条为“Plus-C”OBP，24条为典型OBPs;对30条结构较完整的南亚实蝇OBPs序列与黑腹果蝇D. melanogaster（58条）、瓜实蝇B. cucuribitae（34条）、地中海实蝇C. capitata（28条）、橘小实蝇B. dorsalis（47条）OBPs序列进行进化分析表明（图4），B. tauOBP多数至少与一种实蝇OBP同源物聚类在一支，且拥有80%以上的序列一致性，仅有极个别B.tauOBP与同一支上的实蝇OBP序列一致性较低，如C29372.graph_c0与BdorOBP（AKM45842.1）序列一致性仅为44%且在进化树中形成一个独立的小分支，表明不同种类的实蝇OBPs出现了各自的分化。

3  讨论

副信息素类引诱剂从发现其对实蝇相关种类雄性具有强引诱活性开始，就一直在实蝇综合防治和监控上发挥着重要作用^[8]，在很多地区甚至是唯一的防治措施。但在施用过程中发现：相关实蝇种类的雄虫取食少量的引诱剂不但不会死亡还可大幅度提高其交配竞争能力以及对雌性的吸引力^{[6， 16]};实蝇经过一段时间的ME处理后不但有助于性成熟^[17]，且其当代和后代雄性对ME的敏感性下降，有些学者据此担心副信息素类诱剂不合理的使用会导致田间出现其抗性种群^[8];实蝇辐照成为不育雄蝇后，对引诱剂的反应活性降低且开始反应的日龄推迟，饲喂一定量的引诱剂后交配能力得到一定程度的恢复^[18]，据此副信息素类引诱剂被广泛应用到实蝇SIT项目中^[19]。为探讨副信息素类引诱剂使用对南亚实蝇嗅觉相关基因的影响，进而指导其在实蝇监测、防治中的合理应用，本研究综合考虑转录组测序的特点^[20]和南亞实蝇当时的发育历期^[21-22]，对正常饲养、辐照处理、副信息素类引诱剂诱导下的虫源在不同日龄进行了混合取样和测序。

该样品通过组装共获得36 109条Unigenes，其中N50长度为1897 bp，获得了测序和组装结果较好，能满足后续对功能基因挖掘要求的转录本文库。进一步将得到的Unigenes通过Blast与7大公共数据库进行同源性搜索获得21 127条Unigenes（58.51%）的注释，其中在NR注释成功的Unigenes数目最多，20 948条（58.01%），且在NR数据库中，注释到地中海实蝇C. capitata上的Unigenes最多，为12 526条，占在NR数据库中总注释Unigenes的58.80%;注释到黑腹果蝇D. melanogaster上的Unigenes为3112条，占在NR数据库中总注释Unigenes的14.86%，这不但说明了地中海实蝇与南亚实蝇的亲缘关系较近，也进一步说明了此转录本文库组装和注释的正确，还有，这2种昆虫都有基因组数据，这为下一步南亚实蝇功能基因的挖掘和生物信息学分析提供了便利。同时，利用GO、KOG数据库对南亚实蝇Unigenes进行了基因功能分类和功能预测，用KEGG数据库对南亚实蝇6442条Unigenes进行了代谢通路初步分析，这为下一步挖掘功能基因及开展靶标基因的克隆及功能验证提供了基础数据。

嗅觉在昆虫寄主定位与选择、躲避天敌、寻找配偶、产卵行为等生命活动中发挥着感知寄主挥发物、昆虫利它素、昆虫信息素等气味物质的重要作用，昆虫在长期进化过程中形成了一套高度专一、极其灵敏、复杂的嗅觉系统，系统中涉及OBP、CSP、OR、SNMP、IR、G-Protein和ODE等多种蛋白家族^[23]。其中OBP的功能是将外界疏水性的气味分子运载到嗅觉神经树突膜上的感觉受体（OR），是昆虫实现嗅觉信号转导的第一步，也是目前研究较多、机理了解最多的一步。在该转录本中，我们初步筛选出了528个嗅觉相关基因，其中包括34个OBPs、3个CSPs、20个Ors、43个IRs、204个G蛋白基因、5个SNMPs和219个ODEs。204个G蛋白基因中包括13个小G蛋白基因;ODEs包括细胞色素P450基因150个，谷胱甘肽S-转移酶基因（Glutathione S-transferase）22个，醛脱氢酶基因（Aldehyde dehydrogenase，ALDHs）25个、醇脱氢酶基因（Alcohol dehydrogenase，ADHs）22个。34个OBPs中有28条具有完整的开放阅读框，氨基酸序列大多符合Cys-X_20-66-Cys-X₃-Cys- X_21-43- Cys- X_8-14-Cys-X₈-Cys、Cys-X_15-39-Cys-X₃-Cys- X_21-44Cys- X_7-12-Cys-X₈-Cys或X_22-68-Cys-X_25-68- Cys-X₃- Cys–X_31-46-Cys-X_8-29-Cys-X_8-9-Cys-X_5-71典型OB Ps的结构特点^[24-25]，与黑腹果蝇D. melanog aster、瓜实蝇B. cucuribitae、地中海实蝇C. capi ta ta、橘小实蝇B. dorsalis在NCBI上已登录的所有OBPs中至少有一条同源物聚类在同一支，且拥有80%以上的序列一致性，这为下一步借鉴这些实蝇在基因组方面的研究成果进一步挖掘研究南亚实蝇OBPs及其他功能基因提供了依据，也为下一步以该蛋白为基础，探讨南亚实蝇对副信息素的引诱机理并筛选新的引诱成分提供了基础数据。

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