垂体瘤患者外周血T细胞和NK细胞LAG3 表达的研究①

吴其艳 吴亮亮 彭耀军 贾兴旺 刘天懿 颜光涛

(解放军医学院,北京 100853)

垂体瘤是腺垂体细胞引发的单克隆肿瘤，约占所有脑肿瘤的15%～20%，仅次于脑膜瘤及脑胶质瘤[1,2]。虽然被认为是良性肿瘤，但多达25%～55%的垂体瘤显示出与恶性肿瘤相似的特征，如向周围组织侵袭生长、生长速度较快且尺寸较大，具有较高的复发率，对常规治疗(包括放射治疗)抵抗等，给患者生命健康造成极大威胁[3,4]。近期研究认为，垂体瘤的侵袭行为和复发与免疫系统关系密切[5]。T细胞和NK细胞是参与抗肿瘤免疫应答的主要免疫细胞，其抗肿瘤免疫应答的产生需要多种信号通路的参与，包括正性调节和负性调节通路。淋巴细胞活化基因3 (Lymphocyte-activation gene 3, LAG3)是近年来发现的重要的免疫抑制受体之一,主要表达于活化的T 细胞和 NK 细胞表面，具有多种生物学功能[6,7]。越来越多的研究表明，有效抗肿瘤应答的匮乏可能与LAG3的负性调控作用相关[8]。目前,尚未见有关垂体瘤患者外周血免疫细胞 LAG3 表达的报道。本研究应用流式细胞术检测垂体瘤患者和健康志愿者外周血T细胞和 NK 细胞表面 LAG3的表达变化，初步探讨垂体瘤的免疫抑制机制，为垂体瘤的诊治寻找有效的生物标志物。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1资料 选取2017年至2018年解放军总医院神经外科接受治疗的30例垂体瘤患者，其中男15例，女15例，年龄52(25～72)岁。所有患者均经术后病理确诊为垂体瘤，采血前均未接受手术、放疗及化疗等抗肿瘤治疗，且排除自身免疫性疾病、急慢性感染及其他恶性肿瘤等。其中促性腺激素型垂体腺瘤14 例，混合型垂体腺瘤6 例，催乳素型垂体腺瘤4例，生长激素型垂体腺瘤2 例，促肾上腺皮质激素型垂体腺瘤2 例，无功能型垂体腺瘤2 例。选择同期30例健康人为健康对照组，其中男15例，女15例，年龄50(22～65)岁，两组间性别、年龄差异无统计学意义。

1.1.2试剂 鼠抗人CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PE-CY5、CD8-FITC、CD56-APC荧光素标记单克隆抗体购于美国Beckman Coulter公司；鼠抗人LAG3-PE、IgG1-PE(同型对照)荧光素标记单克隆抗体购于美国BD公司；人外周血单核细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；采用BD FACS CantoⅡ流式细胞仪进行检测。

1.2方法 收集垂体瘤患者及健康对照组静脉血，用EDTA抗凝，采用密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。PBMC样本采用500 μl PBS 重悬，每个流式管加入50 μl 细胞悬液，每个样本检测均设置单阳对照和同型对照，依次加入以下抗体各5 μl：①CD45-KO；②CD3-PC7；③CD4-PC5；④CD8-FITC；⑤CD56-APC；⑥IgG1 K-PE；⑦LAG3-PE；⑧CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PC5、CD8-FITC、CD56-APC、IgG1 K-PE；⑨ CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PC5、CD8-FITC、CD56-APC、LAG3-PE；室温避光孵育20 min，加1 ml PBS混匀终止反应，2 000 r/min 离心3 min，重复洗2次后弃上清液，加入500 μl PBS 重悬细胞，流式细胞仪检测CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞和CD3-CD56+NK 细胞的比例，及各细胞亚群LAG3分子的表达，采用Flowjo软件进行结果分析。

2 结果

2.1垂体瘤患者T细胞和NK细胞比例的变化 流式细胞术选取外周血中CD45+的白细胞，检测其中CD4+T、CD8+T和 NK 细胞的比例(图1)。结果显示，垂体瘤组 CD4+T 细胞比例较健康对照组显著增高[(48.020±4.554)% vs (44.090±5.957)%，P=0.005 7]，如图2A所示。垂体瘤组与健康对照组CD8+T细胞比例分别为 (22.720±6.835)%和(21.55±4.63)%，两者无统计学差异(P=0.442 5)，如图2B所示。垂体瘤组与健康对照组NK 细胞比例分别为 (7.937±3.137)% 和 (11.930±2.767)%，垂体瘤组 NK 细胞比例较健康对照者显著下降，差异有统计学意义(P<0.001)，见图2C。

2.2垂体瘤患者外周血T细胞和NK细胞LAG3的表达 分别选取外周血CD4+T、CD8+T和NK细胞，检测其表面抑制性受体LAG3的表达(图1)。结果显示，与健康对照组相比，垂体瘤患者外周血CD4+T细胞表面LAG3的表达显著增高[(18.450±6.462)% 和 (11.610±9.364)%，P<0.01] (图3A)；同样，垂体瘤患者外周血CD8+T 细胞表面LAG3的表达显著增高[(37.85±13.04)%和(18.04±11.76)%，P<0.001](图3B)； 与此同时，垂体瘤患者外周血NK 细胞表面 LAG3的表达显著增高[(32.94±13.8)% 和 (19.34±10.64)%，P<0.001](图3C)。

图1 流式细胞术检测人外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞和 NK 细胞表面LAG3表达的流程图Fig.1 Expression of LAG3 on CD4+T cells,CD8+T cells and NK cells

图2 垂体瘤患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞和 NK 细胞的比例Fig.2 Frequency of CD4+T cells (A),CD8+T cells (B) and NK cells (C) in patients with pituitary adenomasNote: HC.Healthy control group；PA.Pituitary adenomas group;Left panel.Representative flow cytometry results；Right panel.Summary graphs represent the frequency of indicated cells between the two groups.

图3 垂体瘤患者外周血CD4+T、CD8+T和NK细胞表面LAG3的表达Fig.3 Expression of LAG3 on CD4+T cells (A),CD8+T cells (B) and NK cells (C) in patients with pituitary adenomasNote: HC.Healthy control group；PA.Pituitary adenomas group;Left panel.Representative flow cytometry results;Right panel.Summary graph represents the frequency of indicated cells between the two groups.

3 讨论

垂体具有特殊的免疫特性，在解剖学上与大脑相连，却不受血脑屏障的保护，因此能够接受血源性免疫细胞的攻击[9]。有研究指出，垂体瘤免疫微环境中具有不同程度炎症免疫细胞浸润[10,11]。辅助性 T 细胞，包括 Th1/Th2 和 Th17细胞，通过产生多种细胞因子，参与垂体瘤的炎症应答；与此同时，免疫细胞产生的不同细胞因子，能诱导和募集不同的免疫细胞亚群，共同参与垂体瘤的进展[12]。本研究表明，垂体瘤患者外周血 CD4+T 细胞比例增高，然而具体机制尚不清楚，鉴于CD4+T细胞亚群的异质性，仍需要进一步明确各亚群细胞比例变化对垂体瘤患者免疫功能的影响。与大多数报道一致，研究中并未观察到与健康组CD8+T细胞比例存在差异，可能仍需要扩大样本量或者进一步细化细胞亚群后进行研究。此外，垂体瘤患者NK细胞比例与健康组相比显著降低，较低数量的NK细胞可能影响机体的免疫防御功能，使其无法发挥有效的抗肿瘤免疫应答[13]。

LAG3作为天然免疫和适应性免疫的一种重要调节子，在肿瘤的免疫耐受中发挥着不容忽视的作用。LAG3的分子结构与CD4相似，能够以更强的亲和力与MHCⅡ结合，抑制特异性CD4+T细胞增殖和细胞因子分泌，从而限制CD4+T细胞的抗肿瘤免疫应答。多种肿瘤，如卵巢癌、肾癌、黑色素瘤和淋巴瘤等通过高表达LAG3介导CD8+T 细胞的功能耗竭[14,15]。此外，LAG3在调节性T细胞表面组成性表达，促进其发挥免疫抑制功能[16]。Kotaskova等[17]发现，在慢性淋巴细胞白血病中，高表达 LAG3 预示了较差的预后。大量证据表明，LAG3 的功能与 PD-1 类似，能够抑制T细胞的过度活化和增殖，从而促进肿瘤逃逸，而封闭LAG3 后，T 细胞耗竭状态可被逆转[18-21]。目前，已开展多项临床研究，评估阻断LAG3与其经典配体MHCⅡ结合所达到的抗肿瘤作用[6,22]。值得注意的是，LAG3能够抑制CD8+T细胞和NK细胞的功能，并不依赖于和MHCⅡ结合，提示可能有其他的机制共同参与LAG3介导的免疫抑制；研究其选择性结合的配体及免疫学作用，或将为免疫治疗提供新的思路[23]。我们进一步分析了外周血 CD4+T、CD8+T 和 NK 细胞表面 LAG3 的表达，发现垂体瘤患者外周血3种免疫细胞表面 LAG3 表达的阳性率均显著高于健康对照者，提示 LAG3 可能参与介导了垂体瘤患者的免疫耐受，在垂体瘤的进展中发挥了重要作用。下一步将继续深入研究 LAG3 对垂体瘤患者免疫功能的影响和其作为肿瘤标志物的可能性。

综上所述，本研究发现垂体瘤患者外周血 CD4+T 细胞比例增高，NK 细胞的比例显著降低，而 T 细胞和 NK 细胞表面 LAG3 的表达显著增高，进一步探究 LAG3 在垂体瘤中的生物学功能及其分子机制，或将为垂体瘤的诊治提供新的靶点。