不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌发酵和冻干的影响

李晓军，马跃英，郭跃东，王海霞，冯 谦，王春颖，李康宁，黄少磊，刘彦民

（内蒙古双奇药业股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010010）

乳酸菌是工业上公认的发酵能力最强的微生物，主要用于益生菌和乳酸生产。尽管如此，乳酸菌发酵过程中通常受到产物乳酸的抑制，导致生长速度减缓或停止，从而不能达到理想的细胞浓度或者乳酸浓度。目前，常用的浓缩培养方法主要有缓冲盐法、化学中和法、透析培养法、膜过滤法和微胶囊培养法等。从成本和应用规模上考虑，只有缓冲盐法和化学中和法更适合大规模的生产。一般情况下，研究人员以缓冲盐法配合化学中和法来实现更高的菌体密度。常用的中和剂有碳酸钙、氢氧化钙、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾[1]。我国工业上常用碳酸钙作为乳酸发酵的中和剂。目前，针对不同类型的酸中和剂对乳酸菌的生长和产酸影响的研究比较多[2]。但是，关于不同目数碳酸钙对乳酸菌发酵和冻干的影响的研究非常鲜见。以保加利亚乳杆菌为研究对象，系统比较了不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌发酵和冻干的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

保加利亚乳杆菌NQ2508。

1.1.2 培养基

改良MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠 5 g，吐温 -80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，碳酸钙2 g，蒸馏水 1 000 mL，pH值6.6。MRS检测培养基：在以上改良MRS培养基的基础上加入15 g的琼脂粉。冻干保护剂配方：脱脂乳200 g，乳糖120，谷氨酸钠10 g，抗坏血酸10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 主要试剂

乳酸为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司提供；100目，200目，325目，600目，800目和1 250目轻质碳酸钙，天津燕东矿产品有限公司提供。

1.1.4 主要仪器及设备

J2-21型离心机（BECKMAN）、超净台BCN-1360，哈尔滨东联公司产品；1029型厌氧培养箱，Forma scientific公司产品；2014-025Bb型真空冷冻干燥机，上海东富龙公司产品。

1.2 方法

1.2.1 不同目数碳酸钙中和乳酸能力比较

配制含不同目数碳酸钙的MRS培养基各200 mL，于121℃下灭菌15 min。冷却至室温后，分别以50%的乳酸滴定，每次每组加入的量均为50μL，加入后摇瓶5 s，然后测定pH值，直到所有组的pH值均降到4.5以下，停止滴加。比较各培养基pH值降到4.5时滴加乳酸的量。根据乳酸的滴加量来初步比较各种碳酸钙中和乳酸的能力。

1.2.2 不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌生长影响

将保加利亚乳杆菌菌种在MRS液体培养基中活化2代后，按5%的接种量分别接种于含不同目数碳酸钙的MRS培养基中，厌氧培养箱于37℃下培养。每隔1 h取样测定发酵液活菌数和pH值，以活菌数和pH值为纵坐标、时间为横坐标，绘制生长曲线。比较不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌生长的影响。

1.2.3 不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌冻干影响

将保加利亚乳杆菌菌种在MRS液体培养基中活化2代后，按5%的接种量分别接种于含不同目数碳酸钙的MRS培养基中，厌氧培养箱37℃下培养。培养至对数生长后期时，于4℃下各发酵液以转速8 000 r/min离心20 min，弃去上清，离心得到的菌体以2倍质量的保护剂悬浮，然后进行真空冷冻干燥（预冻：-40℃，2 h；升华干燥：-30～-8℃，8 h；解析干燥：8～25℃，4 h）。得到的冻干粉进行活菌数检测，并计算冻干存活率。冻干存活率的计算方法为：

2 结果与分析

2.1 不同目数碳酸钙中和乳酸能力比较

含不同目数碳酸钙的MRS培养基灭菌后的pH值基本一致，都在6.5左右。但每种培养基中和乳酸的能力却有很大差别。同样将培养基pH值降到4.5，325目的碳酸钙所消耗的乳酸最多，为1 450μL。初步可以判断325目碳酸钙的中和能力较其他几种要强。

不同目数碳酸钙中和乳酸的能力比较见图1。

图1 不同目数碳酸钙中和乳酸的能力比较

2.2 不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌生长的影响

各试验组的生长曲线见图2。

图2 各试验组的生长曲线

由图2可知，各试验组接种后经过短的缓慢期（约2 h）后，进入对数期，在发酵到6～8 h，时，菌体从对数期进入稳定期。可见，使用325目的碳酸钙的试验组3在8 h后进入稳定期，比其余各组晚2 h，对数期时间的延长，也使得发酵液活菌数得到了很大的提升。其中，试验组3的发酵液活菌数最高，达到19×108CFU/mL，与其他组相比，有显著性差异 （F=21.90，p＜0.01）。

2.3 不同目数碳酸钙对保加利亚乳杆菌冻干的影响

在对数末期和稳定性前期收获各组发酵液，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，并计算冻干存活率。由表1和图3的结果可以看出，试验组3的冻干存活率较高，与其他组相比，差异具有统计学意义（p＜0.01）。

3 结论

碳酸钙的目数越高，粒径越小。粒径的大小决定了碳酸钙颗粒的比表面积及颗粒上孔的大小和数量。在碳酸钙颗粒上的孔可以为乳酸菌提供一个相对有利的微环境[3]。首先，碳酸钙外壳可以使孔内细胞保持较高的活性水平，保护细胞不受研磨力和剪切力的影响。其次，乳酸菌产生的乳酸一旦被释放到细胞外溶液中，这部分乳酸就会被其周围的碳酸钙快速消耗，从而导致细胞周围溶液中游离乳酸浓度的降低。从而降低游离乳酸的反馈抑制作用，提高细胞微环境的pH值[4]。研究得到的结果显示，使用325目碳酸钙的试验组3的发酵液活菌数和冻干存活率最高，其次是使用800目碳酸钙的试验组5。目数太大和太小的试验组发酵液活菌数和冻干存活率均不高。可能的原因是，小目数的碳酸钙质量大、易沉底，大目数的碳酸钙质量小易漂浮，只有325目的碳酸钙处于悬浮状态，与乳酸菌的接触面积最大，且其比表面积和孔的大小及数量也适宜。

表1 各试验组的冻干存活率（±s）

表1 各试验组的冻干存活率（±s）

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图3 各试验组的冻干存活率

研究的不足之处在于，没有从微观角度证实不同目数碳酸钙形貌之间的区别，及保加利亚乳杆菌与碳酸钙颗粒之间的相互作用的机理。但是，研究的实际应用价值还是非常大的。首先，为乳酸菌发酵中和剂的筛选又创造了一条新途径和一种新的思路。其次，研究结果可进一步通过中试试验和生产试验的验证，应用于生产中，提升产能。