骨膜蛋白基因敲除鼠正畸牙齿移动模型的建立及验证

郭薇，房付春，徐会勇，欧阳钧

1.南方医科大学口腔医院病理科，广东广州510510；2.南方医科大学南方医院口腔科，广东广州510515；3.南方医科大学基础医学院解剖教研室，广东广州510515

前言

牙齿在正畸治疗过程中，牙周膜受到机械力刺激发生改建，众多细胞因子、炎症介质和生长因子参与这一过程［1-3］。我们前期研究证实在机械力刺激下牙周膜中的骨膜蛋白（Periostin,PN）表达水平显著升高，且其表达与TGF-β1相关［4］。有研究表明，PN作为TGF-β1的下游因子，具有趋化心肌细胞，促进胶原合成和成熟，形成稳定的胶原网络和参与胶原重塑的功能［5-6］。PN主要通过刺激TGF-β1信号系统参与反馈机制，由αv-整合素阳性成纤维细胞表达。生成的蛋白能进一步增加成纤维细胞的流动性、收缩性和合成基质蛋白的能力。PN成为这个反馈机制中的板机点［7-8］。TGF-β1信号相关通路是否也在正畸牙齿移动过程中介导PN对牙周膜的改建作用?基于以上问题，本研究拟通过小鼠正畸牙齿移动模型和基因敲除小鼠正畸牙齿移动模型研究TGF-β1--PN牙周膜相关信号通路分子，进一步揭示PN对牙周膜在机械力作用下改建的分子生物学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型建立

实验所需的PN 基因敲除小鼠是中国科学院广州分院生物医药与健康研究院李鹏研究员惠赠，为C57 转基因基因敲除鼠。所有动物的饲养及繁殖条件为室温18～25 ℃，湿度40%～60%。每天应给予足够的鼠粮，饮用水经121 ℃、30 min高压灭菌，每周至少更换垫料2次，保证其干净。

1.2 实验分组

根据前期结果［4］，本实验选择5 d加力效应最大时间点。实验分为C57小鼠未加力组5只、C57小鼠加力5 d组5只，加力方法同实验一［9］；基因敲除小鼠组上颌加力牙组5只、未加力牙5 d组5只，饲养条件同实验一。将实验小鼠按实验要求处死后拔出牙齿放于盛有裂解液的EP管中，并搔刮牙槽窝去组织于EP管中。

1.3 显微CT（Micro-Computed Tomography, Micro-CT）影像学检查

处死未加力12周龄的C57和PN基因敲除小鼠，分离上下颌骨，分别选取各组小鼠上、下颌骨。每组标本都贴上标签并固定在特殊的扫描管中，以防止滑动影响扫描效果。断层扫描成像采用Micro-CT（uCT80）成像系统。选择小视场成像扫描，校正断层扫描值，电源功率设置为30 W，电流为429 μA，扫描电压为70 kV，扫描层厚为20 μm，每次扫描一个下颌骨大约需要20 min。扫描后，文件存储在计算机中，供后续观察与分析［10］。

1.4 PN基因敲除小鼠基因型的鉴定

PN基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR引物为：

mPN1:5'-CCTTGCCAGTCTCAAYGAAGG-3'

mPN2:5'-TGACAGAGTGAACACATGCC-3'

mPN3:5'-GGAAGACAATAGCAGGCATGCTG-3'

按照mPN1：mPN2：mPN3=2：1：1 的比例混合后加入ddH20稀释成10倍工作液后使用。以上引物由Invitrogen 公司合成。

1.5 RT-PCR 检测小鼠牙移动牙周膜改建中与PN 相关信号通路调控因子

1.5.1 引物的设计与合成 根据GenBank提供的相关序列，应用Primer primier 5软件进行设计，经BLAST软件同源性分析选择特异性引物，由Invitrogen 公司合成。引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.5.2 从组织样本中提取总RNA 用于提取总RNA的容器都已经进行去Rnase 处理。加样枪及玻璃器皿 已 用 RNaseZapTM （Rnase Decontamination solution）试剂处理；用含1/1 000 DEPC无菌水浸泡塑料制品24 h，经两次120 ℃、30 min 条件进行高压灭菌，60 ℃烤干；1/1 000比例的去离子水加入DEPC处理24 h后，高压消毒［11］。

1.5.3 逆转录 取100 ng～2 μg总RNA，加入2 μL gDNA Remover，用移液器轻柔吹打5～10 次混匀，室温（19～27 ℃）反应5 min，置于冰上待用；向gDNARemover处理过的总RNA中加入5 μL的4x RT Master Mix，然后加ddH2O补足至20 μL；加好试剂后，用移液器轻柔吹打10次充分混匀。逆转录反应条件：42 ℃、15 min。

1.5.4 RT-PCR RT-PCR 反应体系如表2所示。利用上述逆转录的cDNA，采用特异的引物扩增，进行实时RT-PCR，检测基因敲除小鼠牙周膜组织中PN、FAK、TGF-β1 等基因的mRNA 表达水平；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸34 s，35个循环，反应结束后得Ct值。

1.5.5 数据分析 用2-△△Ct方法进行RT-PCR结果分型，得到相关基因表达差异值。对每个样本的Ct值算得平均值后（3复孔求平均值），通过减去各自内参的平均Ct值得到△Ct值。减去需要比较的两个样本之间的△Ct值得到△△Ct值。计算2-△△Ct，得到相关基因表达差异倍数。统计学分析使用SPSS 13.0软件，采用单样本t检验进行分析比较，取α=0.05为检验标准。

表2 RT-PCR反应体系Tab.2 RT-PCR reaction system

2 结果

2.1 基因敲除小鼠的鉴定

小鼠基因组DNA经PCR电泳后的结果如图1所示，C57 小鼠的DNA 样本放置于1 泳道，用于鉴定的基因小鼠的DNA样本放置于2泳道。从图中可以看出1 泳道只有一个亮度很强的目的条带，其范围在691bp处，可根据标准判定为WT小鼠；2泳道也只有一个亮度较强的目的条带，范围在500bp 左右，根据标准判定为PN-/-小鼠（基因敲除小鼠）。试验中所用基因敲除小鼠必须经过基因鉴定后才能使用。

图1 小鼠基因组PCR鉴定结果Fig.1 Mice genomic PCR identification results

2.2 Micro-CT影像学检查结果

小鼠Micro-CT 三维重建图显示：与对照组C57小鼠相比，PN-null 小鼠（基因敲除小鼠）牙周组织破坏，牙槽骨出现明显的水平吸收，磨牙根分叉区完全暴露（图2a 和图2b）。小鼠Micro-CT 曲面断层图显示：与对照组C57小鼠相比，PN-null小鼠牙周组织破坏，牙槽骨出现明显的吸收，牙槽脊顶消失，牙周膜连续性中断破坏（图2c和图2d）。

图2 Micro-CT影像学检查结果Fig.2 Examination results of Micro-CT

2.3 小鼠牙移动牙周膜改建中与PN相关的信号通路调控因子

根据图3所示，与C57未加力对照组相比，C57小鼠牙加力实验组牙周膜中PN mRNA表达增强，差值有统计学意义（P=0.024）；粘着斑激酶（Focal Adhesion Kinase, FAK）mRNA 表达增强，差值有统计学意义（P=0.027）；TGF-B1 mRNA 表达增强，差值有统计学意义（P=0.025）。

与PN-null未加力对照组相比，PN-null加力实验组牙周膜中FAK mRNA 表达增强，差值有统计学意义（P=0.016）；TGF-β1 mRNA表达显著增强，差值有统计学意义（P=0.001）。与PN-null未加力对照组相比，C57未加力组牙周膜中TGF-β1 mRNA表达显著减少，差值有统计学意义（P=0.004），FAK mRNA表达显著增强，差值有统计学意义（P=0.005）。与PN-null加力组相比，C57加力实验组牙周膜中TGF-β1 mRNA表达显著减少，差值有统计学意义（P=0.01）；FAK mRNA表达显著增强，差值有统计学意义（P=0.002）。

3 讨论

图3 RT-PCR检测C57和PN-null小鼠加力和不加力牙周膜TGF-β1、FAK和PN mRNA水平的表达Fig.3 The mRNA levels of TGF-β1,FAK and PN in the periodontal ligament of C57 and PN-null mice with or without receiving orthodontic force detected by RT-PCR

建立生物研究模型在生物医学等各方面的研究中都非常重要。基因敲除技术通常用于某种特定基因缺失的研究模型［12］，借助细胞生物学、分子生物学和动物胚胎学的技术，通过胚胎干细胞将生物正常的功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，从而研究该基因的功能［13］；还可以通过外源基因来替换研究宿主基因组，以便测定其是否具有类似的功能，从而进行相关的研究［14］。人类很多疾病都由基因决定，因此构建相应的基因敲除动物模型是研究人类疾病的理想方法［15］。本实验为了清楚了解PN在小鼠牙移动牙周膜改建中的作用以及相关信号通路，通过检测PN基因敲除后相关通路调控因子表达的变化，从而研究PN在小鼠牙移动牙周膜改建中的角色，这需要对建模用的PN-null小鼠进行鉴定。PN+/+基因型小鼠基因组DNA经PCR扩增产物大小为691bp，PN-/-基因型小鼠基因组DNA经PCR扩增产物大小为500bp，本实验中1泳道放置C57小鼠的DNA样本，2泳道放置作鉴定的基因小鼠DNA样本，可以看出1泳道只有一个亮度很强的目的条带，其范围在691bp处，可根据标准判定为WT小鼠；2泳道也只有一个亮度较强目的条带，范围在500bp左右，根据判定标准判定为PN-/-小鼠，可用作后期的进一步研究。

Micro-CT是利用X线成像原理的新型高分辨率三维成像设备，它可以通过牙齿和骨骼等硬组织的高分辨率X线成像获得高精度的三维图像，且不会损坏样本，可对结构、密度和体积进行定量分析［16-17］。与普通CT相比，Micro-CT可以利用锥形X光束获得真正的各向同性体积图像，从而提高空间分辨率和射线利用率，该技术可以在样品完好的情况下对骨骼、牙齿和生物材料进行高分辨率（＜10 μm）X线成像，并获得详细的内部结构信息，从而进行各部分的三维重建图像。Micro-CT拥有的图像处理软件可以从任意角度观察研究对象的三维图像和断层图像，定量计算样本内选定区域的孔隙率、连接密度、面积、结构模型及体积指数等指标［18］。Micro-CT广泛应用于骨形态和骨量的各种研究，包括骨生长发育分析、肾性骨病和骨质疏松症等病理状态的动物模型分析、三维血管重建下的骨折愈合分析及关节软骨形态学分析等［19］。

本实验采用Micro-CT 对C57 小鼠和PN-null 小鼠进行上下颌骨扫描三维重建发现，与对照组C57小鼠相比，PN-null小鼠牙周组织破坏，牙槽骨出现明显的水平吸收，磨牙根分叉区完全暴露。小鼠Micro-CT曲面断层图显示：与对照组C57小鼠相比，PN-null小鼠牙周组织破坏，牙槽骨出现明显的吸收，牙槽脊顶消失，牙周膜连续性中断破坏。仅仅把PN基因敲除，没有其他任何干预的情况下，基因敲除小鼠在正常咀嚼力作用下牙周组织出现严重破坏，充分说明PN 在维持牙周膜等牙周组织完整性方面不可或缺，它在牙周膜、牙周组织的改建更新中扮演着非常关键的角色，可能会调控其他信号分子影响牙周组织的代谢，这与Rios等［20］研究结果基本一致。

根据前期的研究，我们知道牙周组织的改建是牙周膜对不同机械力产生反应的结果。牙周膜是怎样将这种机械信号转化为生物信号的呢？牙周膜为复杂、多细胞和血管的软结缔组织，包含许多独立的细胞群。主要细胞类型是内皮细胞，包括马拉色上皮细胞、成骨细胞、感觉细胞、破骨细胞、成牙骨质细胞及成纤维细胞［21-22］。研究发现许多细胞因子、炎性介质、生长因子等在这一过程中起着非常重要的作用。PN是一种新发现的多功能的细胞外基质蛋白，研究发现PN是牙周内环境稳定和承受机械应力后重塑所不可缺少的［23］。PN作为细胞外基质蛋白，能影响细胞的迁移、细胞外基质合成、细胞粘附、细胞的增殖与凋亡等［24］。研究表明PN可与I型胶原直接相互作用，透射电子显微镜和形态分析表明，PN基因敲除小鼠皮肤真皮层的胶原纤维直径减小，形成异常的I型胶原纤维。此外，差示扫描量热法显示PN基因敲除小鼠中胶原蛋白变性温度较低，反映交联胶原蛋白水平降低。这些结果表明PN可以调节I型胶原纤维形成，从而成为纤维结缔组织生物力学性质的重要介质［25］。

目前，PN与TGF-β1的关系受到各界越来越多的关注。许多研究表明PN参与多种系统性疾病的发生和发展，其表达与TGF-β1密切相关［26］。现已公认TGF-β 1可诱导PN的高表达，说明PN可能作为TGF-β1的下游因子发挥作用，但TGF-β1诱导其表达的机制还不清楚。研究结果显示在PN基因敲除小鼠情况下TGF-β1表达反而升高，说明TGF-β1作为PN调控基因的上游参与机械力对牙周膜改建的过程，其在PN基因敲除小鼠因为PN基因缺失，作为上游的调控因子会按照原始意图代偿增加PN的量以弥补其表达不足，因此PN-null小鼠的TGF-β1表达升高，可能是通过下游信号因子PN负反馈引起，这与Sen等［27］研究基本一致。

本研究发现与PN-null未加力对照组相比，C57未加力组牙周膜中FAK mRNA表达显著增强，与PN-null加力组相比，C57加力实验组牙周膜中FAK mRNA表达显著增强。说明FAK mRNA在PN基因敲除其在牙周膜的表达量减少，二者具有一致性，说明FAK是PN调控信号通路的下游分子，接受PN调控参与机械力对牙周膜改建的过程。但是FAK在PN基因敲除小鼠情况下牙周膜中仍然有表达，说明FAK可能除PN信号通路之外，还接受其它上游因子调控参与正畸力对牙周膜改建的过程，也就是说在牙周膜接受应力刺激进行改建过程中，FAK并不是单一的只有TGF-β1--PN--FAK信号通路，还接受其它信号通路参与牙周膜改建。这与Hakuno等［28］研究基本一致，研究发现，PN敲除鼠梗死区边缘AKT磷酸化形式的单体显著减少，梗死区边缘仅表达少量FAK磷酸化形式，提示心肌成纤维细胞PN蛋白趋化是通过FAK-AKT磷酸化途径实现的。以上研究提示我们有可能在正畸作用下牙周膜的改建过程，其中一个信号调控通路可能是TGF-β1--PN--FAK信号通路通过AKT磷酸化来激活细胞外基质的改变。由于在QCR不能对P-AKT进行检测，而且小鼠牙周膜过少也难以进行P-AKT蛋白水平功能检测。人牙根粗大，牙周膜面积大，有足够的牙周膜组织进行蛋白功能水平检测，因此通过人牙周膜加力改建进行蛋白水平检测可以进一步在蛋白功能水平深入探讨PN在正畸牙齿移动过程中牙周膜改建作用机制。

综上所述，PN 参与调控了正畸作用下牙周膜的改建过程，是保持牙周膜的结构和功能完整性所必需的，TGF-β1--PN--FAK信号通路参与调控了正畸作用下牙周膜的改建过程，PN作为TGF-β1调控通路的下游，其可能通过负反馈机制引起TGF-β1 在PN 基因敲除小鼠表达升高，FAK可能通过除PN信号通路之外的其他途径参与正畸力对牙周膜改建的过程。