单细胞测序技术流程及其应用

张子祺 张永康 谢辉 孟凡孝

摘 要：细胞是生命活动的基本单位，是人们的重点研究对象。阐释生命活动的规律，就必须要对细胞的通讯、免疫、复制、调节等活动的生化途径进行深入研究。不同细胞之间存在“异质性”，但传统上的研究方法无法突破“单细胞”这一条件的限制，因此实验结果反映的更是多个细胞之间的平均结果，所以有些疾病如“癌症”无法被精确地检测出来，相反单细胞分析可以更精确地了解每个细胞之间的表达情况，将会应用在很多领域例如：神经生物学、干细胞生物学等方面，本文将归纳单细胞分析的基本流程，并列举些许应用实例。

关键词：单细胞测序;应用;流程

1 绪论

传统上的细胞分析方法局限于细胞群，这种方法存在一定局限性，细胞群所转录或表达的产物代表这个细胞群平均水平，然而低分子量的物质却难以检测到，因此我们所得出的结论就不能应用于单个细胞，就不能解释很多现象，例如：同一种药物施加于同一组织的相邻的细胞具有不同的功效。单细胞分析将研究对象转移至单个细胞，更适合于细胞的‘异质性研究，其在神经生物学、医药方面、微生物、发育生物学等各个领域具有广泛的应用前景。

2 基本流程

2.1 分离

分离、获得单细胞是单细胞测序的第一步，现在有很多分离单细胞的技术，例如：显微操作技术、激光捕获切割技术、荧光激活细胞分选、微流控技术等等。[2]荧光激活细胞分选的优点是准确度高，通量大，缺点是需要大量的悬浮细胞作为材料;显微操作技术优点是操作方便成本低，缺点是通量低并且容易损害细胞;激光捕获切割优点是保护要捕获的细胞，不破坏细胞周围组织结构，缺点是价格高昂;[3]梯度稀释法的优点是价格低廉，但是容易出现分离错误。

2.2 扩增

（1）单细胞全基因组扩增技术。首先，将所获得的单细胞溶解，获得微量DNA，其次利将所得到的微量DNA进行高效扩增，从而获得高度覆盖的基因组。其中，扩增技术分为两类，有如‘兼并核苷酸引物技术这类基于PCR的全基因组扩增技术，以及如：‘多重置换扩增技术这类不基于PCR的全基因组扩增技术。不同的扩增技术适用于不同的测序、分析技术。

（2）单细胞转录组扩增技术。将单个细胞的mRNA通过PCR逆转录为cDNA，再进行扩增，从而获得大量的转录组。SMART是现今最常用的一种方法，当然还有其他诸如：Phi29聚合酶扩增技术、STRT技术等转录组扩增技术。

2.3 测序

单细胞测序涉及到两个方面：转录组和基因组，测序过程中针对单个细胞的DNA和RNA分别进行分析与比较，从而找到基因组和转录组之间的差异与变化。[7]

3 应用

3.1 单细胞分析技术在肿瘤研究方面的应用

肿瘤细胞存在异质性，从细胞群的角度观察肿瘤细胞，无法找出不同细胞之间的差异，从而会限制对肿瘤细胞的研究。通过单个肿瘤细胞的测序，我们可以研究肿瘤发生、新陈代谢的过程，同时认识各种肿瘤细胞之间及个体之间存在差异的起因和肿瘤疾病产生的根源所在。

3.2 单细胞分析技术在人类细胞图谱计划中的应用

人类细胞图谱计划的意义在于，它将用于识别细胞类型，解释遗传变异体，定义病理表征和标记，并促进相关试剂如抗体、探针等的开发，细胞图谱的解析需要结合多种技术手段，其中建立单细胞分析平台对细胞进行分离和鉴定是构建细胞图谱的前提。

3.3 单细胞测序技术在神经生物学中的应用

有研究表明当神经干细胞向神经细胞进行分化时，不同的神经细胞之间存在着差异。（长散在核元件会通过反转录转座在基因组内发生跳跃形成新的插入，而且每个神经元可能含有独特的长散在核元件插入，[2]因此神经细胞也适用于细胞异质性的研究。

3.4 单细胞测序技术在医药方面的应用

单细胞分析应用在了很多医药研究方面的领域，借助这一技术，研究者们可以在单细胞水平研究许多疾病和生物进程，包括神经细胞基因组异质性、癌变和肿瘤进化、肿瘤转移中的循环肿瘤细胞、早期胚胎发育和不可培养的细菌等，极大改变了我们对这些生物现象的理解。

3.5 单细胞测序技术在微生物方面的应用

宏基因组技术，所展现的是环境中全部的微生物分析结果，该结果代表数量上占据优势的微生物。而单细胞测序技术可以将从环境中所得的微生物进行逐一分析，从可以将基因组分析具体到单个微生物，因此，所得到的结果更贴近于个体，发现新的微生物几率便会更高。[3]

4 结语

单细胞分析技术和宏基因组技术相比，其不同之处在于可以分析单个细胞的基因表达情况，更好地比较不同单个细胞之间的差异，从而揭示传统上难以解决的问题，如：为什么相邻的细胞对同种药物反应不同;为什么早期癌症难以被诊断。当然它也有当今难以解决的问题：扩增偏倚性，敏感性低下，容易污染等等。其次，我们可以看到单细胞分析的应用前景相当广泛例如：人类细胞图谱计划、神经生物学、医药方面、微生物、发育生物学等等领域，都已有研究成果或者有一定的研究潜力。

相信随着细胞分选技术的改进，以及全基因组及全转录组扩增技术的不断完善，单细胞分析的灵敏度以及准确度将会进一步提升，该技术也会更广泛的被应用在各个领域中。

参考文献：

[1]盛湲，李恒宇.從单细胞水平看肿瘤异质性[J].中华乳腺病杂志（电子版），2014，8（06）：384-390.

[2]朱忠旭，陈新.单细胞测序技术及应用进展[J].基因组学与应用生物学，2015，34（05）：902-908.

[3]董燕，宋程程，黄鹤.单细胞测序技术研究进展[J].化学工业与工程，2015，32（01）：71-78.

[4]刘佳，刘震.单细胞分析技术研究进展[J].色谱，2016，34（12）：1154-1160.

[5]董芳，袁卫平，程涛.单细胞技术在干细胞研究中的应用[J].中国细胞生物学学报，2013，35（01）：86-91.

[6]熊虎，张蒙，杨立，吴松.单细胞转录组测序在肿瘤异质性研究及临床中的应用[J].生命科学，2015，27（10）：1306-1311.

[7]文路，汤富酬.单细胞转录组高通量测序分析新进展[J].遗传，2014，36（11）：1069-1076.

[8]贾昌路，张瑶，朱玲，张锐.转录组测序技术在生物测序中的应用研究进展[J].分子植物育种，2015，13（10）：2388-2394.

[9]王兴春，杨致荣，王敏，李玮，李生才.高通量测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志，2012，32（01）：109-114.

作者简介：张子祺（1998-），男，山东济南人，本科在读，山东农业大学生物工程专业。