微小RNA21对鳞癌细胞生物学影响的研究

王巍　张连齐　杨海燕　夏燕云　李建豪

【摘 要】目的：探讨微小RNA-21在口腔鳞癌组织中的表达水平，及其对鳞癌细胞系中的生物学功能的影响。方法：实时荧光PCR定量检测10例口腔鳞癌标本中微小RNA21的表达情况。口腔鳞癌细胞系转染微小RNA抑制剂后，检测其对鳞癌细胞的增殖、侵袭及凋亡的影响。结果：微小RNA21在口腔鳞癌组织中表达明显上调，与对照组比较有显著差异。微小RNA21抑制剂转染鳞癌细胞系后，细胞的周期发生了变化，细胞凋亡比率增高，侵袭能力下降。结论：微小RNA21在口腔鳞癌组织中表达上调，微小RNA21可以抑制口腔鳞癌细胞的凋亡、促进癌细胞增殖，起到了类似原癌基因的作用。

【关键词】口腔鳞癌；微小RNA；增殖；凋亡

【中图分类号】R36 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）01-0011-01

颌面部的恶性肿瘤以口腔鳞状细胞癌最多见，所占比例在80%以上，其具有侵袭局部周围组织及区域淋巴结转移的特点，晚期还可发生远处转移[1]。目前，在手术中还无法做到肿瘤外科与整形外科完全兼顾，治疗后患者多存在明显的功能障碍和容貌破坏，严重威胁人们的身心健康。微小RNA参与很多肿瘤的发生发展过程，其中微小RNA21在多种实体瘤细胞中表达升高，并且起到粗癌基因的角色[2]。在口腔鳞癌的发生发展中最重要的机制是细胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最终导致细胞增殖和（或）凋亡调节失控[3]。因此，本课题研究微小RNA21在口腔鳞癌细胞系中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般資料 本研究中参与的病人均于术前签署手术知情同意书。病理标本收集自2017年1月至2017年12月间，就诊于哈尔滨医科大学附属口腔医院。10对口腔鳞癌组织及相应的癌旁正常粘膜组织均采集自口腔鳞癌患者初次手术切除的外科标本。全部病人在手术前均未经任何放疗和化疗。收集到的标本立刻放入冻存管中，标记清楚储存于-80℃。患者的TNM分期按照2002年美国癌症联盟-国际抗癌联盟TNM分期标准。

1.2 研究方法 提取组织中的RNA，逆转录后实时荧光定量PCR检测细胞中微RNA21的表达情况。培养鳞癌细胞株，收集对数生长期的细胞支撑细胞悬液，实验分为3组，即空白对照组，阴性对照组和实验组。利用酶联免疫方法检测细胞的增值情况，流式细胞分析的方法检测细胞凋亡情况和细胞周期。

2 结果

2.1 微小RNA21在鳞癌组织中的表达 10例样本经RNA提取后，稀释10倍，利用Nano测定RNA浓度，满足纯度的样本进行后续试验。实时荧光定量PCR实验结果显示，10例口腔鳞癌患者组织中微小RNA21呈现高表达。癌周对照组织相对表达值为1，那么癌组织中平均表达水平为1.9259±0.3615，癌组织的表达显著高于配对的癌旁组织（t=2.15，P<0.05）。

2.2 细胞增殖的变化 利用细胞活性（R）计算公式将对照细胞统一记作1.0，便于比较不同浓度实验组的数据。三组细胞培养72小时后，测定细胞增殖情况，数据见表1.微小RNA21抑制剂组细胞活性受到了抑制，经统计学软件分析后，有显著意义。

2.3 细胞周期的变化 细胞转染48小时候，收集细胞，按照细胞周期试剂盒操作，使用流式细胞仪对细胞周期进行检测，使用细胞周期分析软件分析结果显示见表2。转染组处于G1期的细胞所占比例明显高于非特异转染组和空白组，三者之间进行比较，其差异具有统计学意义（P<0.05）；特异性转染组处于S期的细胞所占比例也明显低于非特异转染组和空白组，差异同样具有统计学意义（P<0.05）。

2.4 细胞凋亡变化检测结果 使用BD公司细胞凋亡软件，用Annexinv-FITC和PI标记后24小时内上机检测，结果分析显示：空白对照组和非特异转染组的细胞凋亡率分别为8.94%和7.91%，而转染组的细胞凋亡率是24.24%。空白组合非特异转染组的凋亡比例相似，均小于特异转染组，具有统计学意义。

3 讨论

迄今为止，外科手术仍然是口腔颌面部良恶性肿瘤的主要治疗手段，由于颌面部血管和神经丰富，且解剖结构复杂，为手术治疗制造了很大障碍[4]。而基因治疗自上世纪八十年代开始受到广泛关注，目前采用RNA干扰技术针对癌基因和抗癌基因进行相关干扰，阻止或促进其表达，从而影响特定细胞比如瘤细胞的生物学活性，改变其细胞活性，进而达到抑制细胞生长，延缓肿瘤发展的目的[5]。

本课题选择了10例口腔鳞癌患者的组织标本和鳞癌细胞系作为研究对象，以研究微小RNA21在鳞癌组织中的表达情况。同时，为了去除标本基因表达的个体差异，在肿瘤资质周围采集了正常组织粘膜标本作为对照。研究结果表明：在口腔鳞癌组织细胞中微小RNA21的表达明显升高，而在正常的肿瘤周围组织中微小RNA的表达明显低于实验组。这同其他的一些在其他实体肿瘤进行的实验结果相似，这说明微小RNA21和肿瘤的生物学性状的改变关系密切。本研究结果显示转染微小RNA21抑制剂实验组，当微小RNA21表达受抑制后，鳞癌细胞表达微小RNA21的含量明显减少，与对照组相比有显著差异，证实转染成功。将微小RNA21抑制剂转染入实验鳞癌细胞系后，使用流式细胞仪检测各组细胞增殖、周期和凋亡的情况。结果发现，微小RNA21受抑制后，细胞的增殖活性受到抑制，凋亡细胞明显增多。

以上结果均提示微小RNA21在口腔鳞癌细胞中起着癌基因的作用，能够促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。

参考文献

[1]郑家伟，李金忠，张志愿. 口腔鳞状细胞癌临床流行病学研究现状[J].中国口腔颌面外科杂志，2007；5（2）：83-90.

[2]俞焙秦，刘炳亚.miRNA的生物学特性和功能[J].上海交通大学学报（医学版），2007；5（27）：621-623.

[3]许驰强，肖金刚.转染miR-214抑制物的口腔鳞癌细胞SCC15增殖、迁移、侵袭能力变化及其机制[J].山东医药2016；56（47）：9-12.

[4]朱晓寒，付纪，陈谦明，曾昕.微小RNA与口腔癌前病变[J].国际口腔医学杂志，2012，39（7）：394-397.

[5]陈芬，陈林林.口腔疣状物、口腔鳞癌与癌基因关系的研究进展[J]实用临床医学，2016， 17（1）：92-94.

基金项目：

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（课题编号：12511225）