LC-MS/MS法测定马来酸桂哌齐特中基因毒性杂质(E)3,4,5-三甲氧基肉桂酰氯

刘明 何攀 陈渠玲 谢婷婷 聂蓬勃 闫冬阁

摘要：目的：建立液相色谱串联质谱联法测定马来酸桂哌齐特中杂质（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的检测方法。该方法專属性强、检测限低、稳定性好，回收率高可用于马来酸桂哌齐特生产过程中杂质（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的质量控制。

关键词：马来酸桂哌齐特;（E）-3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯;（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰;液相色谱串联质谱联用

【中图分类号】R314    【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2019）04-247-02

马来酸桂哌齐特化学名称为（E）1-[（吡咯烷羰基）甲基]-4-（3，4，5-三甲氧基肉桂酰基）哌嗪顺丁烯二酸盐，商品名为克林澳，为哌嗪类钙离子拮抗剂 ^[1]，具有多种药理作用，如腺苷增效作用^[2]、扩血管作用 ^[3]、改善血液流变学，广泛用于治疗脑血管疾病，1970年由法国Sanofi-Anentis公司最先生产，并在欧洲、日本等发达国家广泛应用，2002年在中国上市^[1]。

1 仪器与试剂

1.1仪器

液相色谱-串联质谱仪：Agilent 1290-6460，带电喷雾离子源，配Agilent Poroshell 120 EC-C18（100×2.1 mm，2.7μm）色谱柱，毕克氮气发生器。

1.2试剂

甲醇（色谱纯，德国默克公司）;甲酸（色谱纯，国药集团）;乙二胺（优级纯，国药集团）;超纯水（18.25MΩ×cm，中沃水务）;对照品（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯（纯度≥99%，谷川医药科技（湖南）有限公司提供）;对照品（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺（纯度≥99%，谷川医药科技（湖南）有限公司提供）;样品批号（20170901，20170902，2017090，谷川医药科技（湖南）有限公司提供）。

2 方法与结果

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 流动相：甲醇-0.1%甲酸（V/V，50：50），运行时间：7min;色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（100×2.1 mm，2.7μm）流速：0.4ml/min;柱温：35℃;进样体积：5μl。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源ESI;检测方式：正离子多反应监测（MRM）模式;雾化器压力：15psi;离子喷雾电压：4000V;干燥器温度：300℃;干燥器流速：11 L/min;

2.2  溶液配制

2.2.1 对照品溶液 取（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺10mg，用二氯甲烷溶解定容至10mL作为对照品储备液，浓度为1000ng/mL，准确移取对照品储备液用二氯甲烷稀释制成每1mL中含0.005μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 称取100mg样品于10ml棕色容量瓶中，加5ml二氯甲烷旋涡混匀1min，加0.5ml二乙胺，超声反应30min，用二氯甲烷定容至10ml。

2.2.3 3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯溶液：取称定3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯适量，精密称定，加二氯甲烷溶解并定量稀释制成每1ml中含1000μg的溶液。

2.3  系统适用性

分别取溶剂空白、对照品溶液进样测试，其中空白进样1次，对照溶液重复进样5次，记录色谱图的保留时间、峰面积，并计算峰面积的相对标准偏差，结果显示，空白溶液无干扰峰，计算峰面积的RSD为1.10%，色谱峰型对称，表明该方法系统适用性较好。

2.4  专属性

分别取空白溶剂、对照品溶液、供测试品溶液进样测试，实验结果显示在目标物和供测试样品出峰处空白溶剂没有色谱峰，表明该方法专属性良好。

2.5  检测限

取对照品溶液，逐级稀释进样分析，稀释至信噪比S/N=3的浓度为检测限浓度。（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺检测限浓度为0.2ng/ml，折算成（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯为0.0153mg/kg。而该杂质的限量为1.38mg/kg，检测限完全满足质量控制的要求。

2.6  溶液稳定性考察

取对照品溶液、供试品溶液分别在0小时、2小时、4小时、6小时，8小时，每个时间点进样一次，记录对照品溶液和供试品溶液中（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺的保留时间、峰面积;计算平均值及相对标准偏差。

2.7  线性关系考察

分别取对照品储备液适量，用二氯甲烷稀释成对照品标准系列，浓度依次为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL，分别进样，以对照浓度为横坐标（X，ng/mL），峰面积为纵坐标（Y，峰面积），绘制线性回归曲线，其方程式为：Y = 397.942351X + 24.963974，相关系数R=0.9997。结果表明目标物在质量浓度范围1ng/mL～50ng/mL内有很好的线性关系。

2.8 样品测试

取3个批次的马来酸桂哌齐特的样品进行测试，记录峰面积，标准曲线法计算样品中（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的残留量，结果分别为0.039mg/kg、0.045mg/kg、0.054mg/kg。

3 讨论

3.1 分析方法的选择

（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯能与正相色谱固定相，流动相中的醇或水发生反应，因此不能直接用色谱法进行分析，要先进行衍生化反应生成稳定的化合物才能进行色谱分析，利用（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯与二乙胺反应定量生成（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺的原理，对衍生化后的生成物进行色谱分析。

3.2 衍生条件的选择

本文作者在前人研究的基础上对衍生反应进行了验证，添加10μg（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯于样品中，对衍生剂二乙胺的添加量和反应时间进行了正交试验，发现在二乙胺加入量为0.50mL，超声反应时间为30min的时候反应最完全，转化率能达到99.7%。

3.3 溶剂的选择

由于（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯反应活性很强，能与水和醇类物质反生反应，所以不能使用流动相作为溶剂，本文在选择溶剂的时候发现（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯及其衍生物均能在二氯甲烷中能稳定存在，并且在二氯甲烷中溶解度大，二氯甲烷在以甲醇和甲酸水溶液作为流动相的体系中不产生溶剂效应且空白无干扰信号，故本文在配制标准溶液和样品处理的时候均选择了二氯甲烷作为溶剂。

3.4限量规定的讨论

参照欧洲药品管理局（EMA）、美国食品药品管理局（FDA）及人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）颁布的基因毒性杂质控制的指导文件，推荐以毒理学关注阈值（TTC，1.5 μg/天）来控制用药风险。以马来酸桂哌齐特日剂量320 mg/天计算，（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的限度 =1.5ug/天/320mg/天=4.6mg/kg，EMA关于基因毒性杂质限度指南的问答中同时指出，如果在最后一步合成前，实际生成或引入了一个（潜在）基因毒性杂质，可以不将其纳入原料药质量标准中，但是必须保证该杂质在合成中间体中有合理的控制限度并且在原料药检测结果中明确其含量不超过来源于TTC或其他认可标准的30%，即4.6mg/kg×30%=1.38mg/kg，3批次样品测试结果均满足安全限量。

参考文献

[1] 张晓霞， 韩培红. 马来酸桂哌齐特的药理作用及临床应用研究[J]. 中国药房， 2007， 18（26）：2060-2062

[2] 耿洪业， 王少华. 实用药物治疗学. 北京： 人民卫生出版社， 2006： 1060-1061

[3] 冯怡墨， 孙晓川， 张晓冬，等. 依达拉奉联合马来酸桂哌齐特治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的临床观察[J]. 中国药房， 2017， 28（2）：230-232